国外病原微生物快速检测鉴定技术研究进展

在受生物污染或生物武器攻击的战场上，越早检测出生物战剂的种类，越能快速适配治疗方案，降低伤亡，直接关系部队的战斗力和人员安全。目前，国外相关领域的研究正将病原微生物检测能力从实验室推向战场前沿。

一、基础研究方向

1.1从样本到到答案(sample-to-answer)一体化系统

长久以来，病原体快速检测仍以PCR(链式聚合酶反应)技术为主，但其发展方向开始从操作复杂的实验室设备转向小型自动化和低操作门槛的便携式设备。

从样本到到答案一体化系统的目标是将样本处理、核酸提取/富集、扩增、检测、判读等一系列操作过程封装在一次性密封耗材和一个小型仪器内，操作者只需进行极少的步骤，系统即可自动给出定性或定量结果。

表.从样本到到答案(sample-to-answer)一体化系统的组成

美国国防部自2017财年起开始采购由美国BioFire Defense公司研发的Film Array 2.0，该系统可检测临床样本(血液、痰液等)和环境样本(空气、土壤和水)中的生物战剂(炭疽、鼠疫、土拉弗雷热、Q热、埃博拉和马尔堡病毒等)，任何人员(包括无技术背景的人员)可在2分钟内完成上样，并在1小时内出具检测结果。

图. Film Array 2.0系统

另一种被美军广泛使用的设备是美国Cepheid公司的GeneXpert系统。该系统具备多通道检测能力，可在45分钟内出具结果。2022年，美军与该公司签订了5.6亿美元的合同用于相关设备的采购。

图. GeneXpert 4和GeneXpert 16系统

1.2 CRISPR分子诊断

CRISPR分子诊断(CRISPR-Dx)是基于CRISPR-Cas系统的特异性核酸识别能力，利用Cas12/Cas13蛋白被靶序列激活后的“旁切活性”切割荧光报告分子，实现快速信号输出。

相比于传统PCR技术，CRISPR分子诊断的特异性强、可扩展性强、适用范围广、灵敏度极高，因此很适合用于新病原的检测。然而其荧光报告强度和反应动力学受温度和样本抑制等影响，因此整个反应体系并不十分稳定。

图.几种CRISPR分子诊断系统的原理

2022年，美国Sherlock Biosciences公司(CRISPR系统的发明者成立的公司)的产品便采用该技术，已通过FDA的审核用于新冠病毒的检测，但是由于严格的质量控制、批间一致性、干扰验证等因素，该试剂盒仅限于紧急情况下使用。

1.3宏基因组与第三代测序

宏基因组测序(mNGS)是一类非靶向的核酸检测方法,通过对样本中所有的核酸样本进行高通量测序，再通过生物信息学的方法对结果进行识别，从而在一次检测中同时覆盖细菌、病毒、真菌、寄生虫等多类微生物，并能在混合感染或非常规病原场景下提供额外检出价值。

第三代测序是指长读长测序(long-read sequencing)，主要的技术平台是纳米孔测序(ONT)，可以实现边测序边分析，准确率达到99%以上，从样本到初步结果的时间仅需数小时甚至更短。纳米孔测序设备的尺寸十分小巧(通常只有手掌心大小)，可以直接连接到电脑，实时读取检测结果。

图.纳米孔测序原理(左图)和设备(右图)

1.4宿主反应(host-response)

相比于前几种技术，基于宿主反应的检测技术并不是检测病原体本身，而是检测人体在感染后产生的免疫-炎症反应模式，用这些反应模式去判断是否感染以及感染病原的类型、病情严重程度和进展风险。它的优势在于，当病原载量很低、取样部位不理想或病原突变导致靶标检测漏检时，宿主反应仍可能给出“机体免疫系统已经被病原激活”的信号;同时还能在一定程度上区分感染与无菌炎症，从而支持抗菌药物的更精细决策。

目前，制约病原微生物快速检测鉴定技术发展的主要瓶颈是样本的前处理，主要原因在于：

(1)低载量：在感染早期、用药后或血流感染时样本里病原体的含量较少，检测难度高。

(2)强抑制物/复杂基质：血液、痰液、粪便、土壤/污水里有会抑制扩增/酶反应或干扰传感器读数的成分。

(3)裂解与回收效率差异大：革兰阳性菌、分枝杆菌、真菌、芽孢、包膜病毒等难裂解的样本会导致假阴性风险上升。

(4)富集和速度的矛盾：更灵敏的检测技术往往要对样本进行富集和纯化，但这会直接拖慢检测速度。

二、美军的相关研究项目

美国国防高级研究计划局(DARPA)推动了多个病原微生物检测技术的研发项目，包括利用基因编辑技术进行检测项目(DIGET)和表观遗传特征和观察项目(ECHO)。

2.1 利用基因编辑技术进行检测项目(DIGET)

DIGET项目由DARPA于2019年发起，项目周期4年(目前已完成)，依托CRISPR-Cas12/Cas13基因编辑技术，结合等温扩增、微流控、合成生物学和生物信息学技术，目标是解决美军对快速、高可信度、可灵活适配的诊断与生物监测技术的迫切需求。对于该项目，美军要求承包商交付2种产品：

(1)一次性即时诊断试剂盒，可检测多达10种病原体和宿主生物标志物。

(2)用于同时检测1000个或更多样本的可复用检测设备。

表. DIGET项目的技术要求

2.2 表观遗传特征和观察项目(ECHO)

ECHO项目于2018年发起，周期4年(目前已完成)，目标是解决大规模杀伤性武器(WMD)及前体暴露检测的痛点，即现有方法依赖残留的生物痕迹(易消失、浓度低)，且需实验室环境，无法在野外快速应用。项目通过分析个人表观基因组，和暴露后的持久分子印记，实现对WMD暴露的溯源与诊断，支撑军事反恐及防扩散任务。

该项目基于RNA-SEQ(基因表达分析)、ChIP-SEQ(组蛋白修饰检测)、WGBS(DNA甲基化分析)等分子生物学方法结合生物信息学工具和微流控技术，交付2种产品：

(1)ECHO特征检测板：可检测21种暴露特异性特征(4种必选生物制剂+17种自选类别，涵盖化学、放射性、爆炸物等10类)，可区分暴露类型及暴露时间。

(2)便携式集成检测设备：集成样本处理、表观遗传分析、结果解读功能，适用于野外环境，无需专业操作人员。

表. ECHO项目的技术要求

三、总结

总体来看，国外病原体快速检测技术发展的共性特点与趋势如下：

(1)速度和可适配并重：不仅追求分钟级到小时级出结果，也强调新靶点快速上线与大通量检测。

(2)从检病原走向检状态：通过宿主反应和表观遗传等方法，把检测目标从特定病原转向机体状体，提升检测的广谱性。

(3)面向战场前沿：为满足战场的使用需求(检测速度快，人员要求低)，检测设备向小体积、低功耗、低操作难度、结果准确、直观易懂的方向发展。(北京蓝德信息科技有限公司)