Fc效应功能“完全沉默”的理想突变

抗体或Fc融合蛋白“去效应功能化”的方法主要有两种，包括：1）选择与C1q及Fcγ受体亲和力较低的亚类（IgG2或IgG4）；2）引入特定点突变。早期的“沉默”突变包括：N297突变（去除糖基化位点）或L234A/L235A（LALA突变）。

然而，这些突变并不能完全消除与Fcγ受体的结合，也难以完全避免临床上不期望的炎症反应。此后又发展出多种新的沉默突变，但由于各研究使用的检测体系差异很大，缺乏系统比较，难以判断哪种突变的效应功能沉默效果最好（most effective silencing）。有团队构建了一套Fab相同、Fc区各异的IgG抗体库，涵盖国际非专利名称（INN）数据库及文献报道的全部亚类与突变体，并系统比较了它们与人C1q的结合；与人、小鼠、食蟹猴Fcγ受体的结合；在细胞功能实验中的活性。

结果也比较有意思，即便残余亲和力极低的分子，也可在细胞实验中表现出显著功能。迄今为止，临床使用的所谓“沉默”设计几乎没有真正完全沉默的。

免疫球蛋白“效应功能减弱”突变体目录

参照INN数据库和IMGT®数据库，共计发现77种不同突变体可以潜在减弱Fc效应功能，列表如下。其中有一些是用的比较多的“热门”突变体，在INN列表中出现频率最高的8种突变体包括：

IgG1 L234A/L235A；

IgG4 F234A/L235A；

IgG1 N297G;

IgG1 N297A;

IgG1 L234A/L235A/P329G;

IgG4 L235E;

IgG1 L234A/L235A/G237A；

IgG1 L234F/L235E/P331S。

利用表面等离子共振（SPR）检测与Fcγ受体的结合

以CD20抗体作为模板序列。

野生型亲和力概况：1）IgG1、IgG3：对所有检测的FcγR均有显著结合；2）IgG2：强结合人FcγRIIa-131H、猴FcγRIIa和FcγRIIb；对人FcγRIIa-131R及FcγRIIb结合弱；3）IgG4：强结合各物种FcγRI及FcγRIIa/FcγRIIb；引入S228P稳定突变后结合力几乎不变；4）IgG2/IgG4杂交型：对人受体结合显著下降，但对猴受体结合基本保留。

完全沉默的突变体：1）234S/235T/236R（STR）三突变：无论置于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，对所有受体均无可测结合；2）IgG1-E233Δ/L234Δ/L235Δ同样完全无信号；3）在IgG2或IgG2/1背景下，F296A/N297Q（去糖基化）也实现完全沉默。

部分沉默的“热门”突变体：在INN中出现≥7次的“热门”突变（如LALA系列或N297X去糖基化）仍能与≥2个FcγR产生可测结合，提示它们并非真正“沉默”。

单点突变效果：235、238、265、267、273、297、299、322、328、329、330、331等单点突变不足以完全阻断FcγR结合。

与FcγRIIIa(158V)结合方面，STR三突变及若干其他突变体无结合。“热门”突变体中（≥7个INN），仅N297A/G（去糖基化）无结合。

C1q结合（ELISA）

仅野生型IgG3（A₂₉₇₀）和IgG1（A₀₅₇₉）呈阳性；其余所有突变体无可见结合。

Fc效应细胞功能（ADCC/ADCP）

采用Raji（CD20⁺B细胞）为靶细胞；Jurkat报告细胞经转染后携带NFAT-驱动的荧光素酶基因，并表达不同人FcγR。利用Promega报告基因系统进行检测。

结果显示，野生型IgG3虽与受体结合高，但细胞活性远低于IgG1。部分SPR结合微弱的突变体，在细胞实验中显示相对高活性。所有突变体对FcγRIIIa的SPR结合及Promega ADCC反应几乎均为阴性。

另外，采用Svar双荧光报告系统，对Jurkat表达FcγRIIIa-158V、Jurkat表达FcγRIIa-131H的ADCC、ADCP进行了检测。

结果显示，ADCP两系统结果相关良好，但Svar相对信号略低。ADCC作用方面，Svar系统和Promega出现明显差异，前者对多种突变体给出显著信号。

关于“热门”突变体（≥7个INN）的细胞活性：仅IgG1-L234A/L235A/P329G（LALAPG）在所有细胞实验中为阴性；去糖基化N297G/N297A在FcγRI-介导ADCP中呈高活性；其余热门突变体仍与≥2个受体有显著ADCP。

共11种完全沉默的突变体（STR背景+4IgG1+2IgG2+2IgG4+1IgG2/1杂交）在所有ADCP/ADCC实验中均为阴性。

补体依赖细胞毒（CDC）

野生型IgG1、IgG3显示出高活性。IgG2、IgG4野生型及所有突变体均无活性。

IgG1中表现高CDC的突变：1）去糖基化（N297A/G/Q/S/H）；2）L234A/G237A、L234F/L235E/D265A、L235A/G237A；3）单点突变：L235E、D265A、D265S。

其余突变体CDC均被有效沉默。

ADCC、ADCP、CDC结果如下表所示。

差示扫描荧光法（DSF）测定热稳定性

关键参数：Ton（起始熔解温度）；Tm（第一熔解峰温度）

质控与判定标准

野生型IgG1：Ton=63.1℃，Tm=73.2℃

显著降低阈值：Ton<61.9℃；Tm<72.6℃

野生型比较：IgG2、IgG3、IgG4的Ton与Tm均显著低于IgG1。

IgG1突变体（51个）：30个突变体的Ton和/或Tm显著降低。

降低最显著：去糖基化突变（N297X、T299A）。

其他明显降低的突变：L234F、L235E、P238S、D265A、V273E、K322A、L328R、P329G。

稳定性增强：STR三突变（234S/235T/236R）在IgG1–IgG4四个亚类中均使Ton与Tm提高2–4℃

自1980年代初第一个治疗性单抗OKT3进入临床以来，由“非预期炎症反应”引发的副作用始终是单抗疗法的一大障碍。早期研究发现IgG4亚型在体内似乎“惰性”较高，因此在需要避免炎症的场景中优先选用IgG4抗体。但后续工作揭示，由于FcγR家族成员众多、且存在不同基因多态性，IgG4在多数情况下仍具有显著生物学活性。TGN1412（IgG4抗-CD28）的灾难性临床事件就是典型例证。

为彻底“沉默”Fc功能，研究者陆续开发了多种Fc区突变体，最早出现的是N297A（无糖基化）和L234A/L235A（LALA）。这些突变体虽被广泛应用，但并未实现完全沉默，于是又出现了很多新的突变体。

本项研究发现：1）IgG1在所有结合与细胞实验中均为强阳性，作为参照；2）IgG2：FcγRI几乎无活性；FcγRIIa强阳性；FcγRIIb/III弱或阴性；CDC极弱；3）IgG3：所有FcγR结合及CDC均强阳性；除Svar ADCC外，其余细胞实验反应较弱；4）IgG4：FcγRI、FcγRIIa强阳性；CDC阴性；FcγRIII结合及ADCC普遍弱。

绝大多数“沉默”突变体对FcγRIII几乎无结合或功能（SPR或ADCC细胞实验）。

FcγRI与FcγRII的情况更复杂：多数突变体仍保留一定活性，有时甚至接近野生型。值得注意，SPR中仅显示低亲和力结合的突变体，在细胞实验中可能因抗体与受体均固定在细胞膜上而表现出更高“功能亲和力”。

部分突变体能区分FcγRII亚型：IgG1L234A/L235A/G237A与L234A/L235E/G237A对131H-FcγRIIa和FcγRIIb活性高，却对131R-FcγRIIa无活性。

158V-FcγRIIIa的活性一如既往地高于158F等位基因。

“全绿”突变体推荐（见上图），唯一在所有检测中均表现“绿灯”的是4种STR系列：1）IgG1和IgG3：L234S/L235T/G236R；2）IgG2：V234S/A235T/Δ236R；3）IgG4：F234S/L235T/G236R。

其它接近“全沉默”且热稳定性尚可的组合：1）E233P/L234A/L235A/G236Δ/P329A；2）E233P/L234V/G236Δ/S267K；3）L234A/L235A/P329S；4）L234A/L235A/D265S；5）L235G/G236R。