Cell Metab｜瞄准MASH膜鞘脂代谢新靶点：SMPD3驱动脂质摄取与炎症纤维化，双功能分子DC17显示干预潜力！（谢岑/刘雅萌/柳红/谢青团队）

2025年2月26日，中国科学院上海药物研究所谢岑、刘雅萌、柳红团队，联合上海交通大学医学院附属瑞金医院谢青团队，并与上海中医药大学附属龙华医院、临港实验室、上海交通大学医学院附属新华医院、上海科技大学、南京中医药大学、美国国家癌症研究所等单位合作，在Cell Metabolism（中科院1区，2024 Impact Factor=30.9）在线发表题为“Hepatic sphingomyelin phosphodiesterase 3 promotes steatohepatitis by disrupting membrane sphingolipid metabolism”的研究论文。该文于2024年7月15日投稿，2024年12月16日修回，2025年1月17日接收，2025年2月26日在线发表，并发表于2025年5月6日刊期。

代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）是代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）进展中的关键阶段，其特征包括肝细胞脂肪变性、气球样变、炎症和纤维化。目前，如何从单纯脂肪变性进展到MASH，尤其是哪些脂毒性分子真正驱动炎症和纤维化，仍是该领域的重要科学问题。

该研究聚焦肝脏膜鞘脂代谢，发现鞘磷脂磷酸二酯酶3（SMPD3）介导的细胞膜鞘磷脂水解，是MASH阶段神经酰胺积累的重要来源。研究显示，肝细胞特异性敲除Smpd3或药理学抑制SMPD3均可缓解MASH，而重新表达SMPD3则会逆转保护作用，提示SMPD3并非单纯的伴随性改变，而是推动疾病进展的关键节点。

机制上，脂毒性可诱导DNA损伤，激活PARP并消耗NAD+，继而抑制沉默信息调节因子1（SIRT1）活性，最终导致SMPD3转录上调。升高的SMPD3破坏质膜上鞘磷脂-神经酰胺平衡，一方面增强小窝依赖性脂质摄取，促进肝细胞脂质积累；另一方面促进脂肪变性肝细胞释放携带促炎、促纤维化信号的胞外囊泡，加重巨噬细胞炎症极化和肝星状细胞活化。

更值得关注的是，研究者进一步发现双功能分子DC17，可同时激活SIRT1并抑制SMPD3。在饮食诱导的MASH模型中，DC17较单一SIRT1激活剂或SMPD3抑制剂显示出更优的干预效果。该研究不仅提出了“脂毒性-DNA损伤-PARP-SIRT1-SMPD3”这一新的MASH病理轴，也提示靶向肝脏SMPD3、恢复膜鞘脂代谢稳态，可能成为进展期MASH治疗的新方向。

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【摘要】

代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）仍然是重要的健康挑战。本研究发现，鞘磷脂磷酸二酯酶3（SMPD3）可通过增强细胞膜上的鞘磷脂水解，促进肝脏神经酰胺积累，是推动MASH进展的关键因素。

在肝细胞中特异性破坏 Smpd3 基因，或通过药物抑制 SMPD3，均可缓解MASH；而重新引入 SMPD3 则会逆转这种改善作用。健康肝脏中 SMPD3 表达水平较低，但在MASH过程中，脂毒性诱导的DNA损伤会抑制沉默信息调节因子1（SIRT1），进而触发 SMPD3 上调。SMPD3升高会破坏膜上鞘磷脂与神经酰胺之间的平衡，并通过增强小窝依赖性脂质摄取，以及促进脂肪变性肝细胞释放胞外囊泡，加重炎症和纤维化，从而推动疾病进展。

因此，SMPD3可作为整合MASH多个关键病理特征的中心节点。值得注意的是，研究者还发现了一种双功能小分子，可同时激活SIRT1并抑制SMPD3，在MASH治疗中显示出较好的潜在应用价值。上述发现提示，抑制肝脏SMPD3有助于恢复膜鞘脂代谢平衡，并为开发新的MASH治疗策略提供了重要依据。

01

研究背景及科学问题

代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD），既往被称为非酒精性脂肪性肝病（NAFLD），是导致肝硬化、肝癌和肝移植的重要原因之一，影响全球约四分之一成年人。代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）的典型病理特征包括脂肪变性、肝细胞气球样变、炎症和纤维化。MASH是疾病进入需要积极干预阶段的重要节点，但目前有效治疗手段仍然有限。

从单纯脂肪变性进展为MASH的关键驱动因素之一是脂毒性。脂毒性可引发细胞应激、肝损伤、炎症反应和纤维生成。然而，究竟哪些脂毒性分子在其中发挥核心作用，以及这些分子如何触发下游病理事件，目前仍未完全明确。

鞘脂在细胞膜结构和细胞功能调控中具有多重作用。肝脏是鞘脂合成的重要部位，因此也更容易受到脂毒性鞘脂的影响。鞘脂代谢失衡与MASLD发生发展密切相关，其中神经酰胺被认为是脂毒性的重要参与者。神经酰胺处于鞘脂代谢网络的核心，主要通过两条途径产生：一是从头合成，涉及SPTLCs、CERSs和DEGSs等酶；二是鞘磷脂水解。关于从头合成途径在肥胖、糖尿病和MASLD中的作用，已有较多研究。神经酰胺形成后还能进一步转化为鞘磷脂，因此理论上MASLD中鞘磷脂也应明显增加。值得注意的是，MASLD患者常表现为神经酰胺水平升高，而鞘磷脂变化相对较小，这提示鞘磷脂水解可能在MASLD进展中具有重要但尚未充分研究的作用。

鞘磷脂磷酸二酯酶（SMPDs）可在多种刺激下，切除膜结合鞘磷脂中的磷酸胆碱基团，快速生成神经酰胺。根据最适pH以及在不同细胞器、细胞和组织中的分布，SMPDs可分为酸性、中性和碱性家族。对多个MASLD数据集的分析显示，SMPD3，也称中性鞘磷脂酶2（nSMase2），在MASLD肝脏中显著升高。SMPD3主要定位于质膜（PM）内侧小叶和高尔基体，并参与细胞凋亡、应激反应、炎症信号转导以及胞外囊泡（EV）介导的细胞间通讯。由于这些过程与MASLD尤其是MASH的发生机制密切相关，本研究进一步探讨了SMPD3及鞘磷脂水解途径在MASLD/MASH进展中的作用。

本研究发现，MASH患者血清神经酰胺升高主要来源于SMPD3介导的鞘磷脂水解，而非从头合成途径。尽管健康人肝脏中SMPD3表达很低，但在脂肪变性向MASH进展过程中，脂毒性可触发SIRT1依赖的SMPD3上调，尤其是在质膜部位。这一变化进一步增强小窝依赖性脂质摄取，并促进促炎、促纤维化胞外囊泡释放。肝脏Smpd3基因破坏或SMPD3抑制可显著改善MASH。研究者还发现了DC17这一可同时激活SIRT1并抑制SMPD3的双功能分子，其在MASH模型中显示出明显治疗潜力。总体而言，本研究揭示了质膜鞘磷脂-神经酰胺失衡是MASH的特征性代谢改变，并提示SMPD3可能成为有前景的治疗靶点。

02

重要发现及亮点

MASH阶段肝脏鞘磷脂水解与SMPD3表达升高

研究者首先分析了87名受试者的鞘脂谱，包括健康对照者、经肝活检确认的代谢功能障碍相关单纯脂肪变性（MASL）患者和MASH患者。结果显示，血清神经酰胺和二氢神经酰胺在MASL和MASH阶段均明显升高，其中神经酰胺在MASH阶段进一步增加。鞘磷脂也有升高，但其积累程度不及神经酰胺。

为了判断神经酰胺积累主要来自从头合成还是鞘磷脂水解，研究者进一步检测了神经酰胺/二氢神经酰胺（Cer/DhCer）比值和神经酰胺/鞘磷脂（Cer/SM）比值。结果显示，Cer/SM比值随血清神经酰胺水平升高而显著增加，尤其在MASH阶段更明显；相反，Cer/DhCer比值下降。进一步分析发现，神经酰胺和Cer/SM比值与疾病严重程度指标呈正相关，包括NAFLD活动评分（NAS）、血清甘油三酯（TG）、丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、胰岛素和稳态模型胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）。而鞘磷脂本身以及Cer/DhCer比值并未显示出同样的相关性。

在另一个包含168名受试者的验证队列中，研究者也观察到血清神经酰胺和Cer/SM比值在MASLD中升高，并与血清TG、ALT和AST呈正相关。这些结果提示，在MASLD进展过程中，鞘磷脂水解增强可能是导致神经酰胺积累的重要代谢改变。

为了寻找驱动这一变化的具体酶，研究者分析了多个人类MASLD数据集中鞘脂代谢酶的mRNA表达谱。虽然编码鞘磷脂酶的多个基因在MASH进展中有所上调，但SMPD3在MASLD不同阶段均呈持续升高，并与疾病严重程度呈正相关。相比之下，参与神经酰胺从头合成的酶并未表现出一致变化。MASLD患者肝组织切片进一步证实，健康肝脏中SMPD3蛋白表达较低，而从健康对照到MASH阶段，SMPD3表达逐渐升高。

在胆碱缺乏高脂饮食（CD-HFD）诱导的MASH小鼠肝脏中，研究者也观察到类似趋势：Cer/SM比值升高比Cer/DhCer比值变化更明显，同时SMPD3表达上调，而SPTLC2未发生明显变化。在Gubra-amylin MASH饮食（GAN）模型和高脂蛋氨酸/胆碱缺乏饮食（HFMCD）模型中，结果同样一致。MASH阶段的Cer/SM比值高于MASL阶段，且SMPD3上调与MASLD进展同步。值得注意的是，与胞质组分相比，质膜组分中SMPD3表达增强更明显，Cer/SM比值升高也更突出，进一步支持MASH过程中肝脏特定膜结构发生鞘磷脂-神经酰胺失衡。

总体来看，虽然神经酰胺从头合成途径在MASLD不同阶段均有活性，但本研究揭示出一个更具有MASH阶段特征的代谢信号：SMPD3介导的鞘磷脂水解明显增强，尤其发生在质膜结构中，并将MASLD进展与鞘脂代谢紊乱联系起来。

图1：MASH阶段肝脏中SMPD3介导的鞘磷脂-神经酰胺代谢被激活。（A）临床队列1的分组。（B）血清鞘脂热图。（C）血清Cer/DhCer和Cer/SM比值。（D）Cer/DhCer和Cer/SM比值与临床指标之间的相关性。（E）临床队列2的分组、血清神经酰胺、Cer/SM比值，以及神经酰胺与临床指标之间的相关性。（F）GEO数据集中SMPD3表达与临床指标之间的相关性。（G）肝活检样本中SMPD3代表性染色及定量分析；比例尺，50 μm。（H）MASLD小鼠模型示意图。（I）肝脏SMPD3表达的免疫印迹结果，n = 3/组。（J和K）肝脏样本膜组分（J）和胞质组分（K）中SMPD3免疫印迹，以及神经酰胺、SM和Cer/SM比值丰度分析，n = 5–10/组。数据以均值 ± SEM表示。两组之间采用非配对Student’s t检验；多组之间采用单因素方差分析。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。另见图S1。

肝细胞SMPD3缺失缓解MASH，而重新表达SMPD3会逆转保护作用

考虑到肝脏微环境由肝细胞和非实质细胞（NPCs）共同组成，研究者利用MASLD患者单核测序数据分析SMPD3表达来源。结果显示，SMPD3主要表达于肝细胞和胆管细胞。由于肝细胞在肝脏中占比高，可能对肝脏总体SMPD3表达水平贡献更大。值得注意的是，随着MASLD进展，肝细胞中SMPD3表达逐步升高，而胆管细胞中的表达相对稳定。

基于这一结果，研究者构建了肝细胞特异性SMPD3敲除小鼠（HKO）。与对照Smpd3fl/fl（FLOX）小鼠相比，HKO小鼠肝脏和血清中的神经酰胺水平及Cer/SM比值明显下降。在低脂饮食（LFD）条件下，由于SMPD3本身在肝脏中表达较低，SMPD3缺失并未影响小鼠基础代谢特征和肝功能，表现为不同基因型小鼠肝重、ALT、AST、肝脏TG、总胆固醇（TC）和羟脯氨酸（HYP，纤维化标志物）水平相近。

然而，当小鼠接受可诱导MASH的GAN饮食后，HKO小鼠较FLOX对照小鼠表现出明显更轻的疾病表型，提示其对MASH发生具有抵抗作用。尽管低脂饮食下HKO小鼠非酯化脂肪酸（NEFA）水平高于FLOX小鼠，但这些水平仍远低于GAN饮食小鼠；在GAN饮食条件下，不同基因型之间NEFA无明显差异。考虑到衰老会增加人群MASH风险，研究者还让老年小鼠接受GAN饮食，以模拟人类疾病进展。结果显示，老年HKO小鼠同样表现出较轻的MASH症状，并且肝脏中细胞衰老标志物p16和p21表达较低。HFMCD饮食模型中也观察到类似保护作用，提示SMPD3在MASH中的作用并不局限于肥胖相关背景。

进一步地，研究者通过AAV-Smpd3注射建立肝细胞特异性Smpd3过表达模型。出乎意料的是，尽管强制过表达SMPD3可增加肝脏神经酰胺和Cer/SM比值，但并未显著加重MASH病理。这可能提示在特定质膜区域存在“饱和效应”，即SMPD3结合位点有限。为了支持这一可能性，研究者在HKO小鼠中重新引入SMPD3，结果发现其完全逆转了SMPD3缺失带来的保护作用，使MASH严重程度接近FLOX小鼠。即便重新引入SMPD3组的神经酰胺和Cer/SM比值高于FLOX组，其疾病严重程度仍与FLOX相当。为了判断SMPD3的水解活性是否必要，研究者又在HKO小鼠中重新引入失活型SMPD3突变体（D428A,K433A）。与野生型SMPD3不同，该突变体明显削弱了逆转保护作用的能力。

这些结果说明，肝细胞特异性SMPD3缺失可在多个小鼠模型中改善MASH；而重新表达SMPD3则通过质膜鞘磷脂水解加重疾病进展。

为了将小鼠结果与人类MASH联系起来，研究者比较了小鼠模型中的基因表达模式与人类MASLD严重程度特征基因。该特征基因可反映从健康状态、相对良性阶段（MASL和F0-F1）到纤维化/肝硬化阶段（F2-F4）的疾病进展。层次聚类显示，GAN饮食和HFMCD饮食下的FLOX小鼠均与人类纤维化样本（F2-F3）聚类，而GAN饮食下HKO小鼠更接近较轻的人类疾病阶段（MASL/F0-F1），HFMCD饮食下HKO小鼠则接近F2阶段。这提示SMPD3缺失可使疾病表达谱向较早阶段转变。

图2：肝脏SMPD3缺失可保护小鼠免于MASH进展，而在敲除小鼠中重新表达SMPD3会加重疾病。（A）实验示意图，n = 5–7/组。（B）肝脏重量。（C）血清ALT、AST、TG和NEFA。（D）肝脏TG、NEFA、TC和HYP。（E）肝组织切片代表性H&E、油红O和天狼星红染色，以及NAS评分；比例尺，100 μm。（F）实验示意图，n = 5–8/组。（G）肝脏Cer/SM比值。（H）肝脏重量。（I）血清ALT、AST、TG和NEFA。（J）肝脏TG、NEFA、TC和HYP。（K）肝组织切片代表性H&E组织学、油红O和天狼星红染色，以及NAS评分；比例尺，100 μm。（L）实验示意图，n = 5–8/组。（M）肝脏Cer/SM比值。（N）血清ALT、AST和TG。（O）肝脏TG、TC和HYP。（P）肝组织切片代表性H&E组织学、油红O和天狼星红染色，以及NAS评分；比例尺，100 μm。数据以均值 ± SEM表示。两组之间采用非配对Student’s t检验；多组之间采用单因素方差分析。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。另见图S2和图S3。

SMPD3缺失限制MASH发展过程中的肝细胞脂质摄取

为了进一步解释肝细胞特异性SMPD3敲除如何改善MASH，研究者对GAN和HFMCD两种模型的肝脏RNA测序数据进行了通路富集分析。基因本体（GO）分析显示，SMPD3缺失小鼠肝脏中的脂质和固醇代谢过程增强，而炎症和纤维化相关通路下降。基因集富集分析（GSEA）进一步证实，与FLOX对照相比，HKO小鼠的脂质储存、炎症和细胞外基质组织相关通路降低。

随后，研究者检测SMPD3如何影响细胞内脂质含量。结果显示，在基础条件下，SMPD3敲低或缺失影响较小；但在脂肪酸刺激下，SMPD3缺失可显著减少脂质积累，而SMPD3过表达则产生相反效果。值得注意的是，在GAN和HFMCD诱导模型中，SMPD3缺失后肝脏从头脂肪生成（DNL）通路并未发生明显改变。这与既往观察一致，即MASLD中肝脏TG仅约26%来源于DNL，大部分来自脂肪动员和饮食来源。

为探索其他途径，研究者进一步测定了脂质摄取、DNL和脂肪酸氧化。结果显示，SMPD3缺失的原代肝细胞脂质摄取明显降低，而DNL和脂肪酸氧化不受影响。Huh-7细胞实验也得到一致结果：SMPD3敲低抑制脂质摄取速率，SMPD3过表达则增强脂质摄取。在体内实验中，HKO小鼠肝脏对脂肪示踪剂C12-BODIPY的摄取减少；重新引入野生型SMPD3可逆转这一现象，而引入水解失活型SMPD3D428A,K433A突变体则不能逆转。重要的是，各组血清C12-BODIPY水平并未受到影响，提示肝脏脂质摄取下降并不会改变系统性脂质分布。此外，补充神经酰胺可恢复HKO小鼠原代肝细胞和肝脏中的脂质摄取。上述结果表明，SMPD3通过增强脂质摄取促进脂质积累。

SMPD3通过改变质膜鞘磷脂/神经酰胺平衡调控小窝内吞

SMPD3是一种定位于质膜的酶，可在细胞应激状态下将鞘磷脂水解为神经酰胺。与此一致，研究者观察到，与胞质组分相比，SMPD3在膜组分中特异性富集。Smpd3敲除肝脏RNA测序和原代肝细胞蛋白质组学分析显示，SMPD3破坏主要影响质膜相关蛋白和结构区域，例如微结构域、细胞囊泡和内体。

为了明确SMPD3在质膜上的功能，研究者对SMPD3共免疫沉淀产物进行了蛋白质组学分析，发现其与膜蛋白复合体和膜筏存在相互作用，尤其是在肝细胞中与小窝结构蛋白caveolin-1（CAV1）和caveolin-2（CAV2）相互作用。免疫荧光染色进一步证实，棕榈酸（PA）诱导的脂毒性可增强SMPD3表达，并促进SMPD3与质膜小窝共定位。在过表达带标签SMPD3、CAV1和CAV2的HEK 293T细胞中，研究者进一步验证了这些相互作用。类似相互作用也存在于MASH肝脏样本中。

小窝是质膜上富含胆固醇和鞘脂的小型内陷结构，参与小窝介导的内吞和脂质转运。透射电镜（TEM）和RAB5A染色显示，脂质负荷可显著增加小窝和内吞囊泡数量，而SMPD3敲低可减少这一变化。这提示SMPD3可能通过调控小窝介导的内吞，进而影响肝细胞脂质摄取。

为了验证这一假设，研究者进行了脂肪酸摄取实验。首先，使用dynasore抑制内吞后，SMPD3缺失肝细胞中脂质摄取下降的现象被消除，支持其机制依赖内吞过程。其次，通过过表达CAV1、CAV2或二者同时过表达来增加小窝数量，可显著增强脂质摄取；但这一作用可被SMPD3敲低或SMPD3抑制剂DPTIP完全消除。相反，SMPD3过表达促进脂质摄取，而敲低CAV1或CAV2则抑制这一作用。这些结果表明，SMPD3在小窝依赖性脂质摄取中发挥关键作用。

研究者随后进一步探讨SMPD3的质膜定位和酶活性是否为该过程所必需。截短SMPD3的N端膜锚定结构域会破坏其与CAV1和CAV2的相互作用，削弱鞘磷脂水解，并减少脂质摄取。此外，人源SMPD3催化位点突变（K435A）虽然保留了与CAVs的相互作用，但阻碍了有效脂质摄取。以上结果提示，SMPD3的酶活性和质膜定位对于调控小窝依赖性脂质摄取都是必要的。通过改变小窝中的鞘磷脂-神经酰胺平衡，SMPD3促进内吞囊泡从质膜弯曲并脱离，从而推动脂质摄取。

图3：SMPD3通过改变肝细胞质膜原位脂质组成，调控小窝内吞并促进脂质摄取。（A和I）实验示意图。（B）C12-BODIPY摄取；比例尺，10 μm。（C）[1-14C]-PA摄取速率，n = 4/组。（D）原代肝细胞DNL和脂肪酸氧化速率，n = 4/组。（E–G）SMPD3敲低（E）或过表达（F）后Huh-7细胞摄取C12-BODIPY的荧光强度，n = 4/组；以及MASH小鼠血清和肝脏中C12-BODIPY摄取的荧光强度（G），n = 3/组。（H）从MASH小鼠分离的肝细胞膜组分和胞质组分中SMPD3的代表性免疫印迹，n = 3/组。（J和K）在6×His-SMPD3组相对于载体组中，强度位于前50%且倍数变化（FC）≥ 2的蛋白，其最显著富集的GO细胞组分（GO-CC）通路（J）及蛋白（K）。（L）Huh-7细胞质膜上SMPD3与小窝的共定位，小窝以CAV1标记；比例尺，10 μm。（M）肝脏裂解液中SMPD3共免疫沉淀（coIP）实验。（N）Huh-7细胞顶端膜小窝的透射电镜（TEM）图像；比例尺，0.5 μm，n = 3–5/组。（O）Huh-7细胞中RAB5A早期内体标志物的免疫荧光染色；比例尺，10 μm。（P）经或未经dynasore处理的原代肝细胞摄取C12-BODIPY的荧光强度，n = 3/组。（Q）在转染载体或SMPD3质粒并伴随CAV1或CAV2敲低的Huh-7细胞中，C12-BODIPY摄取情况；比例尺，10 μm。（R）SMPD3截短和突变示意图。（S和T）表达全长、截短型或突变型SMPD3的Huh-7细胞中C12-BODIPY摄取情况；比例尺，10 μm。（U）机制示意总结。数据以均值 ± SEM表示。两组之间采用非配对Student’s t检验；多组之间采用单因素方差分析。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。另见图S4。

SMPD3通过调控胞外囊泡释放促进肝纤维化和炎症

脂毒性是MASL进展为MASH的重要标志，可触发肝内炎症和纤维化。在代谢应激下，脂肪变性肝细胞会释放具有病理作用的胞外囊泡（EVs），并通过这些囊泡与非实质细胞沟通，包括巨噬细胞和肝星状细胞（HSCs），进而启动炎症和纤维化反应。SMPD3可生成锥形脂质神经酰胺，促进膜出芽和腔内囊泡形成，因此对EV生物发生非常关键。与这一功能一致，RNA测序数据显示，SMPD3缺失可抑制肝脏炎症和纤维化。

细胞类型解卷积分析进一步显示，HKO可显著减少MASH肝脏中的非实质细胞，包括巨噬细胞和肝星状细胞。为了检测SMPD3缺失是否影响MASH过程中的EV产生，研究者从GAN饮食小鼠肝脏中分离EV。结果显示，与FLOX对照相比，HKO小鼠肝源性EV产生显著减少，无论是小EV群体（<200 nm）还是中/大EV群体（>200 nm）均下降。HKO小鼠来源EV中，EV标志物CD63和肝细胞标志物白蛋白水平降低，进一步证实肝源性EV减少。脂质刺激Huh-7细胞后的TEM结果也支持这一观察，即SMPD3敲低可减少EV产生。

为了明确SMPD3如何影响肝细胞与非实质细胞之间的通讯，研究者首先用PA刺激FLOX或HKO肝细胞，并收集条件培养基（CM），再处理小鼠原代HSC和骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）。与FLOX-CM相比，HKO-CM削弱了HSC活化，表现为Acta2 mRNA表达下降。Acta2编码HSC活化标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）。同时，HKO-CM促使巨噬细胞向抗炎M2表型偏移。流式细胞术也显示，HKO-CM降低M1/M2巨噬细胞比例，提示促炎巨噬细胞减少而抗炎巨噬细胞增加。

体内结果与体外实验一致。GAN饮食HKO小鼠肝脏中α-SMA阳性HSC减少，CD80阳性M1巨噬细胞减少，CD206阳性M2巨噬细胞增多。重新引入SMPD3可逆转这些变化，提示肝细胞中的SMPD3在影响肝脏微环境中巨噬细胞极化和HSC活化方面具有重要作用。

为了判断这些效应是否由肝细胞分泌的EV介导，研究者分别分离肝源性和肝细胞来源EV，并直接刺激BMDMs和JS-1细胞（一种小鼠HSC细胞系）。结果与条件培养基实验一致：与FLOX-EVs相比，来自肝细胞培养物或肝脏的HKO-EVs均可明显降低JS-1细胞中纤维化相关基因及α-SMA蛋白表达，并抑制BMDMs中的M1/M2巨噬细胞极化。去除EV的条件培养基不能影响巨噬细胞极化或HSC活化，进一步确认这些作用由EV介导。重要的是，使用Proteinase K（PK）消化FLOX-EVs中的蛋白成分后，其促炎和促纤维化作用消失，同时FLOX来源EV与HKO来源EV之间的差异也被消除。这提示SMPD3通过肝细胞来源EV中的蛋白货物促进肝纤维化和炎症。

进一步分析脂肪变性肝细胞相关分泌组基因后，研究者发现Smpd3敲除后有12个分泌因子下调。其中，编码骨形态发生蛋白8B（BMP8B）的基因下降最显著。值得注意的是，HKO小鼠肝细胞来源EV和肝源性EV中的BMP8B水平也明显降低。BMP8B属于转化生长因子β（TGF-β）超家族，既往研究提示其可通过BMP-TGF-β通路使HSC转分化为肌成纤维细胞，从而加重MASH进展。重要的是，在TGF-β超家族成员中，BMP8B是唯一一个由脂毒性诱导，并在HKO小鼠肝细胞或肝脏中持续降低的成员。总体而言，这些结果表明，脂肪变性肝细胞中SMPD3上调，可通过EV携带包括BMP8B在内的促炎、促纤维化货物，促进其与邻近细胞通讯，从而加重MASH微环境改变。

图4：肝细胞中SMPD3缺失削弱EV介导的纤维化和炎症。（A）从MASH肝脏分离的EV蛋白浓度，n = 6–8/组。（B）从FLOX和HKO小鼠血清中分离EV后，检测CD63、calnexin和白蛋白的免疫印迹。（C）SMPD3敲低后Huh-7细胞分泌EV的透射电镜图像。（D、H和L）实验示意图。（E和F）纤维化相关基因（E）和炎症相关基因（F），n = 3–4/组；通过流式细胞术检测BMDMs中M1/M2巨噬细胞极化比例，n = 3/组。（G）肝组织切片中α-SMA、CD80和CD206的代表性染色；α-SMA比例尺，100 μm；CD80和CD206比例尺，40 μm。（I、J、M和N）JS-1细胞中纤维化相关基因表达及α-SMA免疫印迹。（K和O）BMDMs培养基中的细胞因子水平。（P–R）原代肝细胞（Q）或MASH肝脏（R）中与肝脏分泌因子相关差异表达基因的韦恩图（P）和热图。（S）肝细胞来源EV和肝源性EV中BMP8B货物装载的免疫印迹。（T）机制示意总结。数据以均值 ± SEM表示。采用非配对Student’s t检验。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。另见图S5。

药理学抑制SMPD3改善饮食诱导的MASH

在遗传学证据的基础上，研究者进一步评估了药理学靶向SMPD3的治疗潜力。DPTIP是一种可口服的SMPD3抑制剂，已显示可剂量依赖性阻断细胞EV释放。当DPTIP用于已经建立MASH的小鼠时，可显著抑制肝脏SMPD3活性，表现为Cer/SM比值和EV释放下降。DPTIP干预后，小鼠MASH病理得到明显改善。组织学分析进一步证实了其作用，包括NAS评分下降、M1/M2巨噬细胞极化降低，以及肝纤维化明显缓解。

为了评估DPTIP处理结果与人类MASH严重程度之间的对应关系，研究者将DPTIP处理小鼠的基因表达谱与人类MASH数据集进行比较。结果显示，DPTIP可显著改善小鼠MASH严重程度，使其表达谱从较进展阶段（F2-F3）转向较早的纤维化前阶段（F0-F1），甚至接近MASL。通路分析显示，DPTIP下调炎症和纤维化相关通路，同时影响与膜筏和微结构域相关的细胞功能。此外，DPTIP还降低了参与MASH进展的多类非实质细胞丰度，包括巨噬细胞、树突状细胞和肝星状细胞。总体来看，这些结果支持SMPD3作为MASH治疗潜在靶点。

图5：DPTIP药理学抑制SMPD3可改善MASH。（A）实验示意图，n = 5–10/组。（B）肝脏中神经酰胺、SM和Cer/SM比值。（C）DPTIP处理小鼠肝脏分离EV的相对数量，n = 4/组。（D）肝脏重量。（E）血清ALT和AST。（F）肝脏TG、TC和HYP。（G）肝组织切片代表性H&E、油红O、天狼星红、α-SMA、CD80和CD206染色，以及NAS评分；α-SMA比例尺，100 μm；CD80和CD206比例尺，20 μm。（H）基于20个人类MASH严重程度同源特征基因表达，通过PCA和聚类分析展示患者MASLD进展以及DPTIP处理MASH小鼠的疾病状态；所有聚类均采用欧氏距离。（I和J）小鼠肝脏GO生物过程（GO-BP）和GO细胞组分（GO-CC）富集分析。（K）肝脏NPCs的ssGSEA评分。数据以均值 ± SEM表示。两组之间采用非配对Student’s t检验；多组之间采用单因素方差分析。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。

脂毒性诱导的DNA损伤通过抑制SIRT1上调SMPD3

鉴于SMPD3缺失可改善MASH，研究者进一步追问：在疾病进展过程中，是什么因素驱动SMPD3上调？为模拟MASH相关应激，研究者使用多种与MASH病理相关的葡萄糖、脂质和应激刺激处理肝细胞。结果显示，脂毒性棕榈酸（PA）和DNA损伤诱导剂阿霉素（Dox）最明显地增加细胞死亡，并诱导SMPD3 mRNA和蛋白水平升高。公共GEO数据集的GSEA结果显示，人类MASLD肝脏中DNA损伤和修复相关通路富集，提示DNA损伤可能参与MASH进展。

以磷酸化γH2A.X（p-γH2A.X）增强作为DNA损伤标志，研究者发现PA和Dox处理均可在肝细胞中触发鞘磷脂水解，这可能与SMPD3表达升高有关。其他DNA损伤诱导剂，包括phenazine（Phen）、顺铂（Cis）和博来霉素（Bleo），同样可升高SMPD3 mRNA表达。在肝细胞和MASH小鼠肝脏样本中，DNA损伤与质膜结合型SMPD3上调之间的关联也得到确认，提示脂毒性相关DNA损伤可能是MASH中SMPD3转录激活的关键驱动因素。

DNA损伤会激活多聚ADP核糖聚合酶1（PARP1），该酶是重要DNA修复酶，但会快速消耗NAD+。与此一致，PA和Dox处理可提高肝细胞PARP活性，并显著降低NAD+水平。PARP抑制剂可逆转这些效应，并降低SMPD3表达。由于PARP1和SIRTs共同依赖NAD+作为辅因子，并在细胞应激下调节生存与死亡通路，研究者提出假设：PARP诱导的NAD+消耗可能抑制SIRT活性。

通过荧光素酶报告系统，研究者发现SIRT1是SMPD3转录的重要抑制因子。使用SIRT1激动剂SRT可下调SMPD3表达，而使用SIRT1抑制剂烟酰胺（NAM）则促进SMPD3表达。与此一致，PA和Dox处理可降低肝细胞NAD+水平和SIRT1活性，这与MASL和MASH小鼠中的观察相吻合；其中，SIRT1抑制特异性出现在MASH阶段。MASH肝脏样本中H3K9和H4K16乙酰化增加，也支持SIRT1活性下降。进一步实验显示，过表达野生型SIRT1可抑制SMPD3表达，而失活突变体H363Y无此作用。染色质免疫沉淀（ChIP）实验证实，SIRT1可降低SMPD3启动子上H3K9Ac和H4K16Ac富集，提示其具有直接转录抑制作用。在体内，抑制SIRT1会加重肝损伤并上调SMPD3，而激活SIRT1则可逆转这些效应。

这些发现共同揭示了一条新的病理级联反应：脂毒性诱导DNA损伤，激活PARP，消耗NAD+，继而抑制SIRT1活性，最终导致SMPD3上调并促进MASH进展。

图6：脂毒性诱导的DNA损伤通过抑制SIRT1导致SMPD3转录上调。（A–C）原代肝细胞中SMPD3和p-γH2A.X的免疫印迹。（D）原代肝细胞中神经酰胺和Cer/SM比值，n = 3/组。（E）Huh-7细胞膜组分和胞质组分中SMPD3的免疫印迹。（F）小鼠肝脏中SMPD3和p-γH2A.X的免疫印迹，n = 4/组。（G–J）在PA和Dox刺激并联合PARP抑制剂AIQ和PJ34处理的Huh-7细胞中，检测SMPD3 mRNA、细胞NAD+以及PAR和SMPD3表达，n = 3/组。（K）不同SIRTs对HEK 293T细胞中SMPD3启动子活性的影响，n = 4/组。（L）SRT1720和NAM对Huh-7细胞、原代肝细胞和L02细胞中SMPD3转录的调控，n = 3/组。（M和N）Huh-7细胞中的NAD+水平和SIRT1活性（M，n = 4/组），以及MASH小鼠肝脏中的NAD+水平和SIRT1活性（N，n = 6–7/组）。（O）小鼠肝脏中SIRT1、SMPD3、H4K16Ac和H3K9Ac的免疫印迹，n = 3/组。（P和Q）L02细胞中SIRT1活性和SMPD3 mRNA表达，n = 3/组，以及SIRT1和SMPD3的免疫印迹。（R）Huh-7细胞中SMPD3启动子区域H3K9Ac和H4K16Ac富集的ChIP-qPCR分析，n = 3/组。（S）机制示意总结。数据以均值 ± SEM表示。两组之间采用非配对Student’s t检验；多组之间采用单因素方差分析。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。另见图S6和图S7。

靶向SIRT1-SMPD3轴的双功能分子DC17缓解MASH

SIRT1缺失与MASH密切相关，而激活SIRT1可缓解疾病。由于SIRT1活性下降是MASH中SMPD3上调的重要驱动因素，研究者提出，若能设计一种同时靶向SIRT1-SMPD3轴的双功能分子，充分阻断SMPD3的致病作用，可能成为MASH治疗的新策略。

DPTIP和SIRT1激活剂20b具有相似的结构框架，均由疏水尾部、连接臂和极性头部三个关键部分组成。分子对接分析显示，疏水尾部可有效占据P1口袋，含氮连接臂形成氢键，而极性头部深入富含极性氨基酸的P2口袋。基于这些相似性，研究者设计了一系列预计可同时激活SIRT1并抑制SMPD3的化合物。对DC系列化合物进行SMPD3抑制活性筛选后，DC17被确定为最强抑制剂。与20b和DPTIP的结合模式一致，DC17可充分占据极性P1口袋和疏水P2口袋，并通过连接臂形成氢键。值得注意的是，DC17对SMPD3的抑制效力强于阳性对照GW4869，同时也能显著激活SIRT1。

为了评估DC17对MASH的治疗效果，并判断其获益来源于双功能特性，还是主要来自SIRT1激动或SMPD3抑制中的某一方面，研究者在已建立的MASH模型中比较了DC17、20b和DPTIP。20b和DC17均可降低肝脏SMPD3表达，但DC17还能进一步抑制残余SMPD3酶活性。因此，在改善MASH关键表型方面，DC17优于20b和DPTIP。这些结果说明，同时靶向两个通路具有协同获益。

为了进一步验证DC17是否通过SIRT1-SMPD3轴发挥作用，研究者在SMPD3 FLOX和HKO小鼠中检测DC17效应。在DC17处理的HKO小鼠中，MASH表型相较于载体处理HKO小鼠并未进一步改善，提示SMPD3活性对于DC17治疗MASH的作用是不可或缺的。值得注意的是，在该实验中，小鼠接受GAN饮食34周以建立进展期MASH后才开始DC17治疗。DC17显示出较强疗效，并有效逆转了MASH相关病理改变，进一步支持SIRT1-SMPD3轴是晚期MASH潜在治疗靶点。

图7：靶向SIRT1-SMPD3轴的双功能分子DC17可缓解MASH。（A）双功能DC系列化合物的设计策略。（B）以GW4869作为阳性对照，检测所选分子对SMPD3的抑制作用，n = 3–4/组。（C）DC17与SMPD3（PDB: 5UVG）和SIRT1（PDB: 4I5I）的预测结合模式。（D）DC17对SMPD3的抑制作用，并以GW4869作为阳性对照，n = 3/组；DC17对SIRT1的激活活性，以SRT501和20b作为阳性对照，以DPTIP作为阴性对照，n = 3/组。（E）实验示意图，n = 7/组。（F）肝脏SMPD3、H4K16Ac和H3K9Ac的免疫印迹。（G）肝脏中神经酰胺、SM和Cer/SM比值。（H）血清ALT和TG。（I）肝脏TG、TC和HYP。（J和K）肝组织切片代表性H&E、油红O、天狼星红，以及α-SMA、CD80和CD206染色，并进行NAS评分；α-SMA比例尺，100 μm；CD80和CD206比例尺，25 μm。数据以均值 ± SEM表示。采用非配对Student’s t检验。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。另见图S7。

【贡献】★★★★★

目前针对MASH的治疗，尤其是以降低总体脂肪积累为目标的策略，在阻止MASL向MASH进展方面效果仍有限。本研究确定SMPD3是连接脂毒性与MASH的关键节点，它整合了脂毒性、炎症和纤维化等重要疾病特征。通过介导质膜鞘磷脂水解，SMPD3促进脂质摄取和胞外囊泡释放，从而驱动MASH进展。

抑制SMPD3，尤其是通过DC17这类双靶向化合物进行干预，为进展期MASH提供了一种有前景的治疗思路，也回应了当前临床中尚未满足的重要需求。未来，进一步开发同工型特异性、肝脏靶向、代谢稳定性更好的SMPD3抑制剂，或探索多靶点干预药物，将有助于推动有效MASH治疗策略的发展。

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