Redox Biology (1区，IF=11.9) I 瞄准血管钙化新机制：Nogo-B激活NRF2-SLC7A11抗氧化轴，抑制VSMCs成骨分化！...

2026年5月19日，合肥工业大学陈元利、杨潇潇团队，中国科学技术大学附属第一医院潘健源团队，纽约大学长岛医学院Qing Robert Miao团队等，联合天津市中心妇产科医院、天津医科大学宝坻医院、华东师范大学、华中科技大学同济医学院、中国科学技术大学附属第一医院、安徽医科大学第二附属医院等单位，在Redox Biology（中科院1区，2024 Impact Factor=11.9）在线发表题为 “Nogo-B attenuates vascular calcification by activating NRF2-SLC7A11 to enhance antioxidant defense” 的研究论文。该文于2026年2月2日投稿，2026年5月8日修回，2026年5月18日接收。 Redox Biology 的 2024 Impact Factor 为 11.9；公开期刊信息显示其在中科院升级版分区中为生物学大类1区、生化与分子生物学小类1区。

血管钙化（vascular calcification，VC）是动脉粥样硬化、高血压、慢性肾病和主动脉瓣狭窄等疾病中常见的血管并发症，可显著增加不良心血管事件风险。血管平滑肌细胞（VSMCs）由收缩表型向成骨样表型转化，是血管钙化发生发展的关键环节。然而，调控这一过程的上游分子机制仍有待进一步阐明。

本研究聚焦网状蛋白家族成员 Nogo-B，发现其在人和小鼠钙化血管中均明显下调，并与血管钙化程度呈负相关。在维生素D3联合尼古丁诱导的小鼠血管中膜钙化模型、人动脉离体钙化模型以及高磷诱导的人主动脉平滑肌细胞（HASMCs）成骨分化模型中，Nogo-B 表达下降均与钙化加重相伴随。进一步功能实验显示，平滑肌细胞特异性敲除 Nogo-B 会加重血管钙化，而过表达 Nogo-B 则可抑制 HASMCs 成骨分化，降低 RUNX2、BMP2 等钙化标志物水平。

机制上，研究发现 Nogo-B 可通过上调氨基酸转运体 SLC7A11 抑制血管钙化。Nogo-B 不仅促进 SLC7A11 表达，还能与 SLC7A11 发生相互作用，并募集去泛素化酶 OTUB1，抑制 SLC7A11 在 K30 位点发生 K63 连接型泛素化，从而稳定 SLC7A11 蛋白。稳定的 SLC7A11 进一步促进谷胱甘肽（GSH）合成，增强细胞抗氧化能力，降低 ROS 水平，从而减轻 VSMCs 成骨分化。

值得关注的是，该研究还揭示了 NRF2-SLC7A11-GSH 正反馈调控环路：Nogo-B 通过 SLC7A11 增强 GSH 合成，改善氧化应激状态；GSH 维持的低氧化应激微环境促进 NRF2 激活和核转位；NRF2 又可结合 SLC7A11 启动子区域，进一步促进 SLC7A11 转录表达。由此，Nogo-B 通过“转录激活+去泛素化稳定”双重机制维持 SLC7A11 功能，增强 VSMCs 的抗氧化防御稳态。

总体来看，该研究提出了血管钙化调控的新机制：Nogo-B 通过 OTUB1/SLC7A11/GSH/NRF2 轴增强抗氧化防御，抑制 VSMCs 成骨分化和血管钙化进展。这一发现为理解血管钙化的氧化应激调控机制提供了新的实验依据，也提示 Nogo-B 可能成为干预血管钙化的潜在分子靶点。但作者也指出，SLC7A11 作为 Nogo-B 下游靶点的体内验证仍需进一步加强，不同血管钙化模型及不同 Nogo 亚型在该过程中的具体作用仍有待后续研究。

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【摘要】

血管钙化（vascular calcification，VC）是指钙盐在血管壁异常沉积，可显著增加不良心血管事件风险。然而，血管钙化的发生机制尚未完全阐明。Nogo-B 是网状蛋白家族成员，既往研究显示其参与内膜新生血管形成、肥胖以及代谢相关脂肪性肝病等多种病理过程，但其在血管钙化中的作用仍不清楚。

本研究采用尼古丁联合维生素 D3（vitamin D3，VD3）诱导 C57BL/6J 小鼠及平滑肌细胞（smooth muscle cell，SMC）特异性 Nogo 敲除小鼠（NogoSMKO）发生血管钙化。同时，研究者在高磷条件下建立了人动脉离体成骨模型，以及人主动脉平滑肌细胞（human aortic smooth muscle cells，HASMCs）体外成骨模型。结果显示，在发生钙化的人和小鼠主动脉以及高磷处理的 HASMCs 中，Nogo-B 表达均显著下调。SMC 特异性敲除 Nogo-B 会加重血管钙化；相反，过表达 Nogo-B 可抑制 HASMCs 的成骨分化。

机制上，Nogo-B 通过上调氨基酸转运体溶质载体家族 7 成员 11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）表达来抑制血管钙化。Nogo-B 可与 SLC7A11 强烈相互作用，并促进去泛素化酶含 OTU 结构域的泛素醛结合蛋白 1（OTU domain-containing ubiquitin aldehyde-binding protein 1，OTUB1）的募集，从而阻止 SLC7A11 在 K30 位点发生 K63 连接型泛素化。此外，Nogo-B 介导的 SLC7A11 上调可增强细胞内谷胱甘肽（glutathione，GSH）合成，进而激活核因子 E2 相关因子 2（nuclear factor E2-related factor 2，NRF2）。NRF2 又可作为 SLC7A11 的转录增强因子。最终，Nogo-B 通过激活抗氧化防御、缓解氧化应激来抑制血管钙化。

本研究确定 Nogo-B 是血管钙化的新型调控因子。Nogo-B 可通过调节 OTUB1 介导的去泛素化来稳定 SLC7A11 蛋白，并增强 GSH/NRF2 信号轴，从而促进谷胱甘肽合成、降低氧化应激，并抑制 VSMCs 成骨分化及血管钙化进展。

01

研究背景及科学问题

血管钙化（VC）是多种心血管疾病中常见且危害较大的血管并发症，广泛见于动脉粥样硬化、高血压、主动脉瘤、慢性肾病以及主动脉瓣狭窄等疾病。血管钙化不仅会增加不良心血管事件发生风险，还会影响血管介入治疗的效果。因此，深入理解血管钙化的内在机制具有重要临床意义。

血管钙化是一个复杂的病理过程，涉及多种细胞类型的代谢重编程和分化。其中，血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）的成骨分化被认为是血管钙化的重要致病机制之一。该过程通常表现为成骨标志基因上调，例如 Runt 相关转录因子 2（RUNX2）和骨形态发生蛋白 2（BMP2）。因此，阻断 VSMCs 的成骨分化，是缓解血管钙化的重要策略。

多种致病因素参与血管钙化进展，其中炎症及其相关氧化应激被认为是血管钙化及相关疾病的重要机制。炎症和细胞应激过程中产生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）可损伤细胞蛋白和细胞组分，进而促进血管钙化及多种心血管疾病发展。例如，H2O2 处理可通过激活 Akt-RUNX2 信号通路加速血管钙化；尼古丁可增加 Nox5 活性，引发氧化应激介导的细胞外囊泡释放，从而推动血管钙化过程。

SLC7A11 是一种膜转运蛋白，在将胱氨酸转运入细胞、促进谷胱甘肽（GSH）合成中发挥关键作用。GSH 是细胞内重要的抗氧化分子。通过促进胱氨酸摄取，SLC7A11 可保护多种细胞和组织免受脂质过氧化和铁死亡损伤。研究显示，SLC7A11 下调可导致脂质过氧化物累积，诱导细胞铁死亡，并促进血管钙化。SLC7A11 的表达可在转录水平和转录后水平受到调控。OTUB1 是去泛素化酶家族成员，可通过识别并切割泛素链，调控多种重要蛋白和信号通路表达。OTUB1 是抑制 SLC7A11 泛素化过程的重要蛋白。

此外，SLC7A11 已被鉴定为 NRF2 的直接靶基因。NRF2 是应对氧化应激的重要转录因子，主要功能是启动细胞内抗氧化应激反应、抑制细胞内氧化应激水平，并增强细胞抵抗氧化损伤的能力。既往研究也提示，多种抗氧化蛋白在调控血管钙化中发挥重要作用。在氧化应激诱导的 HASMCs 表型转变过程中，血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）和过氧化氢酶（catalase，CAT）等抗氧化防御酶可被激活，形成抗氧化防御系统，从而增强 VSMCs 的抗氧化能力并抑制血管钙化。

网状蛋白家族 RTN4，也称为 Nogo，广泛分布于多种细胞类型，参与神经系统功能调控、细胞凋亡等多种生理过程。Nogo 家族包括 Nogo-A、Nogo-B 和 Nogo-C 三个成员。Nogo-A 参与中枢神经系统神经突起形成，而目前关于 Nogo-C 的认识相对有限。相比之下，Nogo-B 在多种病理状态中的作用已有较多研究。既往研究显示，抑制肝脏 Nogo-B 可减轻高碳水诱导的脂肪肝、高胆固醇诱导的高胆固醇血症和动脉粥样硬化。在血管系统中，Nogo-B 可减轻损伤诱导的血管重构；而内皮细胞中的 Nogo-B 则可促进血管功能障碍和高血压。因此，Nogo-B 的作用具有明显细胞类型特异性。然而，Nogo 蛋白在血管钙化中的作用仍需进一步研究。

在本研究中，作者发现 Nogo-B 在临床样本和小鼠模型中均与血管钙化水平呈负相关。随后，研究者进一步探索 Nogo-B 在血管钙化中的作用及功能机制。结果显示，VSMC 特异性敲除 Nogo-B 会加重 VD3 和尼古丁诱导的血管钙化。Nogo-B 可通过转录和转录后机制调控 SLC7A11 水平，从而抑制成骨分化和血管钙化。该研究证实了 Nogo-B 在血管钙化中的关键调控作用，并提示 Nogo-B 可能是抑制 VSMCs 成骨分化的新靶点。

02

重要发现及亮点

Nogo-B 与人和小鼠血管钙化程度呈负相关

为判断 Nogo-B 是否参与调控血管钙化，研究者首先重新分析了单细胞 RNA 测序数据集 GSE159677。该数据集来自 3 例动脉粥样硬化患者的颈动脉钙化核心斑块区域（AC）及其匹配的近端邻近区域（PA）。多细胞类型点图分析显示，RTN4，即 Nogo，在 VSMCs 中表达最高。值得注意的是，与 PA 组相比，AC 组 VSMCs 中 Nogo 表达显著降低；并且在 AC 组中，Nogo 表达与钙化评分呈负相关。GEO 数据集 GSE58150 的分析也显示，与健康人群相比，冠状动脉钙化（coronary artery calcification，CAC）患者外周血清中 Nogo 蛋白水平明显降低。由于 Nogo-B 被认为是 VSMCs 中唯一可检测到的 Nogo 家族成员，作者据此认为 VSMCs 中检测到的 Nogo 蛋白主要为 Nogo-B。

为了验证 Nogo-B 在人血管钙化样本中的表达，研究者收集了 4 例接受颈动脉内膜剥脱术患者的颈动脉粥样硬化斑块样本，其中 2 例存在内膜钙化，2 例无内膜钙化。免疫荧光染色用于检测 Nogo-B 和钙化标志蛋白 RUNX2 的表达。结果显示，在钙化斑块样本中，Nogo-B 表达显著降低。类似地，研究者还检测了慢性肾病（CKD）肾移植受者中钙化和非钙化肾动脉样本的 Nogo-B 与 RUNX2 水平。结果与颈动脉样本一致：在 RUNX2 阴性样本中，Nogo-B 表达较高；而在钙化样本中，Nogo-B 表达降低。

随后，研究者将人动脉壁组织，包括主动脉和外周动脉，在离体条件下用高无机磷酸盐（3 mM Pi）处理 7 天以诱导钙化。茜素红 S 染色和 RUNX2 免疫荧光染色显示，钙化培养基（CM）处理组发生明显钙化。免疫组化和免疫荧光结果均显示，与生长培养基（GM）培养组织相比，CM 培养的人动脉组织中 Nogo-B 表达显著下调。

进一步地，研究者通过对 10 周龄 C57BL/6J 小鼠皮下注射 VD3，并经口灌胃给予尼古丁，建立持续 4 周的主动脉中膜钙化模型。主动脉根部免疫荧光、免疫组化以及主动脉 Western blotting 分析均证实，与对照组相比，钙化小鼠主动脉中 Nogo-B 表达显著降低。由于 VSMCs 是血管钙化中的主要细胞类型，而其由收缩表型向成骨表型转变是血管钙化的关键机制，研究者还使用高无机磷酸盐处理 HASMCs 建立体外钙化模型。Western blotting 结果显示，随着 Pi 诱导时间延长，Nogo-B 表达呈时间依赖性下降，与钙化标志蛋白 BMP2 的表达变化趋势相反。这些发现共同表明，Nogo-B 与血管钙化呈负相关。

图1：Nogo-B 在人和小鼠样本中与血管钙化呈负相关。（A、B）点图显示动脉粥样硬化患者颈动脉钙化核心斑块（AC）和匹配近端邻近节段（PA）中，不同细胞类型内 Nogo 的表达水平（n = 3）。分析钙化评分与 RTN4 的相关性。（C）健康个体与人冠状动脉钙化（CAC）病例血清 RTN4 表达水平（n = 8）。（D）动脉粥样硬化患者非钙化和钙化颈动脉斑块组织切片中 Nogo-B 与 RUNX2 表达的免疫荧光染色（n = 4）。（E）CKD 患者肾动脉切片中 Nogo-B 与 RUNX2 表达的免疫荧光染色（n = 2）。（F–J）收集人主动脉（n = 4）和外周动脉（n = 5），并在离体条件下用生长培养基（GM）或钙化培养基（CM）培养 7 天（F）。采用茜素红 S 染色检测钙化（G、I）。采用免疫组化染色检测 Nogo-B 表达（G、J）。采用免疫荧光染色检测 Nogo-B 和 RUNX2 表达（H）。（K–O）采用 VD3 和尼古丁（VDN）诱导 C57BL/6J 小鼠发生中膜钙化（n = 7）。采用茜素红 S 染色检测钙化（K）。采用免疫组化（IHC）（L）和免疫荧光（IF）染色（M、N）检测 Nogo-B 表达。采用 Western blotting 检测 BMP2 和 Nogo-B 蛋白水平（O）。*P < 0.05。数据以均值 ± SD 表示。P 值采用双尾非配对 Student t 检验计算（B、C、D、H、N 和 O）。

Nogo-B 抑制 HASMCs 成骨分化和血管钙化

为了进一步研究 Nogo-B 在血管钙化中的具体调控作用，研究者在离体人主动脉中转染 Nogo-B 过表达质粒。结果显示，Nogo-B 过表达可降低人主动脉钙化程度和 RUNX2 表达；相反，在人主动脉离体钙化模型中敲低 Nogo-B 表达，则会增加 RUNX2 表达并加速血管钙化。类似结果也出现在小鼠主动脉环离体培养模型中：Nogo-B 过表达减轻钙化，而 Nogo-B 敲低加重血管钙化。

随后，研究者检测了 Nogo-B 对 HASMCs 成骨分化的影响。确认 OE-Nogo-B 转染效率后，将 Nogo-B 过表达的 HASMCs 在钙化条件下培养 4 天，再进行茜素红 S 染色和钙含量测定。与对照组相比，Nogo-B 过表达显著减少 HASMCs 中钙沉积。Western blotting 和 qPCR 进一步显示，Nogo-B 过表达后，钙化标志物 RUNX2 和 BMP2 的蛋白及 mRNA 水平均下降，而收缩表型标志物 SMA 和 SM22α 表达上调。相反，Nogo-B 特异性 siRNA（siNogo-B）可降低 HASMCs 中 Nogo-B 的 mRNA 和蛋白水平，并促进 HASMCs 成骨活性，同时伴随 RUNX2、BMP2 mRNA 和蛋白表达升高，以及 SMA、SM22α 表达下调。

为了在体内验证这一作用，研究者构建了诱导型 SMC 特异性 Nogo 敲除小鼠 NogoiSMKO，并以同窝对照小鼠 NogoWT 作为对照。经基因分型和 Western blotting 确认敲除后，采用 VD3 和尼古丁诱导中膜钙化。全主动脉和主动脉根部切片的茜素红 S 染色显示，与对照小鼠相比，雌雄 NogoiSMKO 小鼠均出现更显著的血管钙盐沉积。主动脉根部免疫荧光染色显示，Nogo-B 敲除明显上调钙化标志蛋白 RUNX2 和 BMP2 表达。

此外，研究者还构建了第二种 SMC 特异性敲除模型 Nogoflox/floxSM22-Cre，即 NogoSMKO，并以同窝 Nogoflox/flox 小鼠作为对照。建立中膜钙化模型后，茜素红 S 染色和免疫荧光分析同样显示，与对照小鼠相比，NogoSMKO 小鼠动脉钙化显著增加，且严重程度与 NogoiSMKO 小鼠相似。肾功能检测结果提示，VSMC 特异性敲除 Nogo-B 后，除雌性 NogoiSMKO 小鼠肌酐水平外，CREA、UREA 和尿酸（UA）水平均升高，提示 Nogo-B 敲除会加速肾损伤。此外，Nogo 敲除还提高了血清钙水平和碱性磷酸酶（ALP）活性，提示钙磷代谢平衡受到干扰。既往研究发现，Nogo-B 敲除可通过调节内皮细胞鞘脂稳态降低血压。作者也检测了小鼠血压，结果显示 VDN 模型中收缩压（SBP）和舒张压（DBP）升高，但与 NogoWT 小鼠相比，SMC 特异性 Nogo 敲除并未进一步影响 SBP 和 DBP。

这些结果表明，Nogo-B 在抑制 HASMCs 成骨分化和血管钙化进展中发挥重要作用。

图2：Nogo-B 抑制 HASMCs 成骨分化和血管钙化。（A）人主动脉壁转染 pcDNA3.1 空载体或 pEGFP-Nogo-B（OE-Nogo-B）质粒，并在钙化培养基（CM，3 mM 磷酸盐，2% FBS）中培养 7 天。采用茜素红 S 染色检测钙沉积（n = 4）。（B）采用免疫荧光染色检测 GFP（代表 Nogo-B 水平）和 RUNX2 表达（n = 4）。（C–E）HASMCs 转染空载体或 OE-Nogo-B 质粒，并在 CM 中培养 4 天（n = 6）。采用茜素红 S 染色检测钙沉积（C）。采用试剂盒测定钙含量（D）。采用 Western blotting 检测 RUNX2 和 BMP2 表达（E）。（F–H）HASMCs 转染 siNC 或 siNogo-B，并用 CM 培养 4 天（n = 6）。采用茜素红 S 染色检测钙沉积（F）。采用试剂盒测定钙水平（G）。采用 Western blotting 检测 RUNX2 和 BMP2 表达（H）。（I–K）采用他莫昔芬诱导 Cre-loxP 系统，实现 SMC 特异性 Nogo 敲除（NogoiSMKO）。随后用 VD3 和尼古丁诱导小鼠发生中膜钙化（n = 6）。实验流程如图所示（I）。采用茜素红 S 染色检测全主动脉（J）和主动脉根部（K）钙化面积。（L–N）采用 SMC 特异性 Nogo 敲除小鼠（NogoSMKO）及同窝对照小鼠（Nogof/f）诱导中膜钙化（n = 6）。实验流程如图所示（L）。采用茜素红 S 染色检测全主动脉（M）和主动脉根部（N）钙化面积。*P < 0.05。数据以均值 ± SD 表示。P 值采用双尾非配对 Student t 检验计算（A、B、D、E、G、H、J、K、M 和 N）。

Nogo-B 通过上调 SLC7A11 抑制 HASMCs 成骨分化

为了寻找 Nogo-B 在 HASMCs 成骨分化过程中的潜在下游靶点和机制，研究者对对照组和 Nogo-B 过表达 HASMCs 进行了 RNA 测序。与对照组相比，Nogo-B 过表达导致 912 个差异表达基因（DEGs）发生变化。KEGG 分析显示，铁死亡、氧化磷酸化以及活性氧代谢调控等通路受到影响。RNA-seq 数据还显示，RUNX2、BMPR1b、BMP2 等成骨相关基因受到抑制，而 CNN1、SMA 等收缩相关基因表达升高。其中，研究者发现调控谷胱甘肽合成、抗氧化稳态和铁死亡的关键枢纽分子 SLC7A11 在 Nogo-B 过表达条件下上调。进一步验证显示，Nogo-B 或 SLC7A11 过表达可抑制 ACSL4、TFR1 和 TFRC 等相关分子表达，提示氧化应激和铁死亡可能参与 Nogo-B 抑制血管钙化的过程。

基于 GEPIA 数据库对正常动脉组织中 RTN4 与 SLC7A11 表达相关性的分析显示，二者在三种动脉类型中呈显著正相关，提示 RTN4 和 SLC7A11 可能在血管系统中存在协同表达模式。Western blotting 和 qPCR 结果进一步证实了 RNA-seq 和在线数据库结果：Nogo-B 过表达显著增加 SLC7A11 水平，而 siRNA 介导的 Nogo-B 敲低则降低 SLC7A11 水平。与此同时，主动脉根部切片免疫荧光染色显示，与对照小鼠相比，NogoiSMKO 小鼠 SLC7A11 表达明显降低。人外周动脉离体培养实验也显示，Nogo-B 过表达可提高 SLC7A11 蛋白水平。钙化的人颈动脉粥样硬化切片中，SLC7A11 表达同样降低。在小鼠中膜钙化模型中，钙化小鼠血管中的 SLC7A11 水平显著低于非钙化对照组。此外，在 HASMCs 中，随着钙化诱导时间延长，SLC7A11 蛋白表达逐渐下降。

为了阐明 SLC7A11 在血管钙化中的功能作用，研究者构建了带 HA 标签的 SLC7A11 质粒，并通过 Western blotting 和 qPCR 确认其转染效率。茜素红 S 染色和钙含量测定显示，SLC7A11 过表达显著抑制 HASMCs 成骨分化，并降低 RUNX2 和 BMP2 的蛋白及 mRNA 表达。相反，siRNA 介导的 SLC7A11 敲低显著促进 HASMCs 成骨分化。离体实验中，在人主动脉壁培养体系中过表达 SLC7A11 可抑制钙化，而敲低 SLC7A11 则有效增加主动脉钙化。此外，使用不同浓度 SLC7A11 抑制剂 HG106 处理 HASMCs 后，成骨分化以剂量依赖方式加重。

为进一步研究 Nogo-B 与 SLC7A11 的功能关系，研究者在 Nogo-B 过表达背景下用 siRNA 敲低 SLC7A11。结果发现，SLC7A11 敲低可阻断 Nogo-B 对 HASMCs 成骨分化的抑制作用。类似地，使用 HG106 抑制 SLC7A11 也可有效阻断 Nogo-B 过表达的抗钙化作用。另一方面，SLC7A11 过表达可显著减轻 Nogo-B 敲低导致的促成骨分化效应。这些结果表明，Nogo-B 通过上调 SLC7A11 水平来抑制血管钙化。

图3：Nogo-B 通过上调 SLC7A11 抑制 HASMCs 成骨分化。（A）RNA-seq 获得的差异表达基因（DEGs）火山图。（B）Western blotting 分析对照组或 Nogo-B 过表达 HASMCs 中 SLC7A11 蛋白表达（n = 6）。（C）Western blotting 分析转染 siNC 或 siNogo-B 的 HASMCs 中 SLC7A11 蛋白表达（n = 6）。（D）Western blotting 检测非钙化和钙化小鼠主动脉中 SLC7A11 蛋白水平（n = 7）。（E）Western blotting 检测 HASMCs 在 CM 诱导不同天数后的 SLC7A11 蛋白水平（n = 4）。（F–K）HASMCs 转染 HA-vector/HA-SLC7A11 质粒或 siNC/siSLC7A11，并在 CM 中培养 4 天（n = 6）。采用茜素红 S 染色检测钙沉积（F、I）。采用试剂盒测定钙含量（G、J）。采用 Western blotting 检测 SLC7A11、RUNX2 和 BMP2 表达（H、K）。（L–N）HASMCs 同时转染 siNC 或 siSLC7A11，以及 pEGFP-C2 或 OE-Nogo-B 质粒，并在 CM 中培养 4 天（n = 4）。采用茜素红 S 染色检测钙沉积（L）。采用试剂盒测定钙含量（M）。采用 Western blotting 检测 SLC7A11、RUNX2 和 BMP2 表达（N）。（O–Q）HASMCs 同时转染 HA-vector 或 HA-SLC7A11，以及 siNC 或 siNogo-B，并在 CM 中培养 4 天（n = 4）。采用茜素红 S 染色检测钙沉积（O）。采用试剂盒测定钙含量（P）。采用 Western blotting 检测 RUNX2 和 BMP2 表达（Q）。*P < 0.05，ns：差异无统计学意义。数据以均值 ± SD 表示。P 值采用双尾非配对 Student t 检验计算（B、C、D、G、H、J 和 K）；采用单因素方差分析并进行 Tukey 事后检验计算（E、M、N、P 和 Q）。

Nogo-B 通过结合 SLC7A11 并招募 OTUB1 稳定 SLC7A11

为了研究 VSMCs 中 SLC7A11 的潜在调控因子，作者首先检测了 Nogo-B 与 SLC7A11 之间的相互作用。HASMCs 中的免疫共沉淀（Co-IP）实验显示，内源性 Nogo-B 可与 SLC7A11 发生物理相互作用。293T 细胞中过表达带标签构建体的互作 Co-IP 实验进一步证实了二者直接相互作用。共聚焦显微镜结果显示，Nogo-B 与 SLC7A11 存在共定位，其荧光强度曲线相互重叠。

接下来，研究者检测 Nogo-B 是否调控 SLC7A11 稳定性。考虑到蛋白降解涉及多种途径，包括泛素-蛋白酶体途径、自噬途径和溶酶体途径，研究者分别使用蛋白酶体抑制剂 MG132、自噬抑制剂 3-MA 和溶酶体抑制剂 CQ 进行干预，以明确 Nogo-B 通过哪一具体途径调控 SLC7A11 蛋白稳定性。免疫印迹结果显示，只有蛋白酶体抑制剂 MG132 能显著逆转 Nogo-B 敲低导致的 SLC7A11 蛋白水平下降，而 3-MA 和 CQ 并未显示明显逆转效应。进一步实验表明，Nogo-B 过表达显著降低 SLC7A11 泛素化水平；相反，Nogo-B 敲低可显著促进 SLC7A11 泛素化。因此，作者确认 Nogo-B 主要通过泛素-蛋白酶体途径调控 SLC7A11 蛋白稳定性。

为了确定 Nogo-B 调控 SLC7A11 稳定性的具体泛素化方式，研究者构建了一系列带 HA 标签的赖氨酸突变泛素过表达质粒。在 Nogo-B 过表达背景下，作者共表达了 5 种不同的泛素变体：野生型泛素（UB）、K48、K48R、K63 和 K63R。泛素化分析显示，K63 特异性泛素突变体能有效逆转 Nogo-B 对 SLC7A11 的去泛素化作用，其效果与未修饰 UB 一致。这提示 Nogo-B 主要通过减弱 K63 连接型多聚泛素化，保护 SLC7A11 免于泛素介导的降解。

为了寻找参与 Nogo-B 介导的 SLC7A11 泛素化调控的特异性去泛素化酶，研究者查询泛素化数据库，并将 OTUB1 确定为 SLC7A11 的潜在结合伙伴。OTUB1 可抑制 SLC7A11 泛素化并增强其稳定性。Co-IP 结果确认，Nogo-B、OTUB1 和 SLC7A11 可在 HASMCs 中形成复合物。鉴于 OTUB1 通过直接结合稳定 SLC7A11，研究者进一步检测 Nogo-B 是否影响这一相互作用。Co-IP 实验显示，与对照组相比，Nogo-B 过表达显著增强 OTUB1 与 SLC7A11 之间的相互作用。

既往研究提示，SLC7A11 的 1–40 位氨基酸区域负责与 OTUB1 结合，而 K4、K12、K30 和 K37 是 SLC7A11 的潜在泛素化残基。研究者成功构建了相应点突变质粒，即 K4R、K12R、K30R 和 K37R。通过在统一特异性敲低 Nogo-B 或 OTUB1 后，分别过表达上述质粒并检测泛素化水平，结果显示，与野生型组和其他点突变组相比，K30 位点特异性突变可显著阻断 SLC7A11 泛素化。这说明 Nogo-B/OTUB1 轴靶向调控 SLC7A11 泛素化修饰的特异性赖氨酸残基为 K30。

研究者还进一步探索了 Nogo-B 与 OTUB1 的调控关系。Nogo-B 过表达显著上调 OTUB1 的 mRNA 和蛋白表达，而 Nogo-B 敲低则下调 OTUB1 表达。在体内和体外实验中，OTUB1 表达水平也与钙化程度呈显著负相关。随后，siRNA 介导的 OTUB1 敲低显著促进 HASMCs 成骨分化，并降低 SLC7A11 表达。此外，OTUB1 敲低大幅削弱了 Nogo-B 过表达对 HASMCs 成骨分化的抑制作用；相反，SLC7A11 过表达可有效挽救 OTUB1 敲低诱导的成骨分化增强。这表明 OTUB1 是 Nogo-B 的关键下游效应分子，可通过稳定 SLC7A11 抑制 HASMCs 的成骨转分化。

图4：Nogo-B 通过结合 SLC7A11 并招募 OTUB1 稳定 SLC7A11。（A）Co-IP 检测 HASMCs 中 Nogo-B 与 SLC7A11 的相互作用（n = 4）。（B）Co-IP 检测 293T 细胞中 Nogo-B 与 SLC7A11 的外源性相互作用，其中 Nogo-B 带 GFP 标签，SLC7A11 带 HA 标签（n = 4）。（C）IF 染色检测 HASMCs 中 Nogo-B 与 SLC7A11 的共定位（n = 4）。（D）HASMCs 转染空载体或 OE-Nogo-B，并用 MG132（10 μM）处理 8 小时。采用 Co-IP 检测 SLC7A11 泛素化水平（n = 4）。（E）293T 细胞转染 Nogo-B 和 Ub 过表达载体（WT、K48、K48R、K63、K63R）。采用 Co-IP 检测 SLC7A11 泛素化。（F）Co-IP 检测 Nogo-B、SLC7A11 和 OTUB1 之间的结合相互作用。（G）Co-IP 检测 HASMCs 中 SLC7A11 与 OTUB1 的结合（n = 4）。（H–M）HASMCs 转染 siNC 或 siOTUB1，或同时转染空载体或 OE-Nogo-B，并在钙化培养基中培养 4 天（n = 6 或 4）。采用茜素红 S 染色检测钙沉积（H、K）。采用试剂盒测定钙含量（I、L）。采用 Western blotting 分析 SLC7A11、RUNX2、BMP2 和 OTUB1 表达（J、M）。*P < 0.05，ns：差异无统计学意义。数据以均值 ± SD 表示。P 值采用双尾非配对 Student t 检验计算（G、I 和 J）；采用单因素方差分析并进行 Tukey 事后检验计算（L、M）。

Nogo-B 通过抑制氧化应激降低 HASMCs 成骨分化

鉴于 SLC7A11 的主要功能是将胱氨酸转运入细胞，进而促进细胞内 GSH 合成，而 GSH 合成是抗氧化应激反应中的关键环节，研究者推测 Nogo-B 和 SLC7A11 可能通过调控氧化应激发挥抗钙化作用。结果显示，NogoiSMKO 和 NogoSMKO 小鼠中 ROS 水平均显著升高。在人主动脉中，Nogo-B 过表达降低 ROS 水平，而 Nogo-B 敲低增加 ROS 水平。通过 DHE 或 DCFH-DA 探针检测发现，Nogo-B 或 SLC7A11 过表达显著降低细胞内 ROS 水平，而 Nogo-B 或 SLC7A11 敲低明显升高 ROS 水平。

此外，MitoSO™ Red 探针检测显示，Nogo-B 或 SLC7A11 过表达可降低线粒体 ROS 水平，而 Nogo-B 或 SLC7A11 敲低则增加线粒体 ROS 水平。相应地，GSH 检测结果显示，Nogo-B 或 SLC7A11 过表达显著提高细胞内 GSH 水平，而 siRNA 介导的任一基因敲低均降低 GSH 水平。Nogo-B 过表达还提高了多种 GSH 合成相关基因表达，包括谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基（GCL）、谷胱甘肽合成酶（GSS）、谷胱甘肽 S-转移酶（GST）、谷胱甘肽-二硫化物还原酶（GR）和谷胱甘肽过氧化物酶 4（GPX4）；而 Nogo-B 敲低则降低这些基因表达。

为进一步明确氧化应激在该调控过程中的位置，研究者使用 H2O2 直接诱导 HASMCs 氧化应激和钙化水平升高。结果显示，在人为升高 ROS 的条件下，Nogo-B 过表达的抗钙化和抗氧化应激作用被阻断，说明 Nogo-B 主要通过抑制内源性氧化应激发挥作用。Western blotting 分析显示，在血管钙化过程中，关键抗氧化因子 NRF2、HO-1 和 CAT 表达下降，而 KEAP1 表达升高。Nogo-B 或 SLC7A11 过表达显著上调抗氧化因子 NRF2、HO-1 和 CAT 的蛋白及 mRNA 水平，同时抑制 KEAP1 表达；相反，Nogo-B 或 SLC7A11 敲低明显升高 KEAP1 水平，并降低上述抗氧化蛋白表达。进一步结果显示，在 Nogo-B 敲低的 HASMCs 中，SLC7A11 过表达可显著降低 KEAP1 表达，并恢复抗氧化蛋白水平；而 Nogo-B 过表达导致的氧化应激相关蛋白上调，则可被 siRNA 介导的 SLC7A11 敲低有效逆转。

图5：Nogo-B 通过抑制氧化应激抑制 HASMCs 成骨分化。（A、B）采用 DHE 荧光探针检测 NogoiSMKO 小鼠（A）或 NogoSMKO 小鼠（B，n = 6）主动脉根部的超氧阴离子。（C）采用 DHE 探针检测 Nogo-B 过表达的钙化人主动脉壁中超氧阴离子水平（n = 4）。（D–G）采用 MitoSO™ Red 荧光探针检测 Nogo-B 或 SLC7A11 过表达或敲低 HASMCs 中的线粒体超氧水平（n = 6）。（H–K）采用 GSH 检测试剂盒测定 Nogo-B 或 SLC7A11 过表达或敲低 HASMCs 中的 GSH 水平（n = 6）。（L、M）Western blotting 检测 OE-Nogo-B（L）或 siNogo-B（M）组中 NRF2、CAT、HO-1 和 KEAP1 表达（n = 6）。（N、O）HASMCs 同时转染 HA-vector/HA-SLC7A11 和 siNC/siNogo-B（N），或同时转染 siNC/siSLC7A11 和 pEGFP-C2/OE-Nogo-B（O），并在 CM 中培养 4 天（n = 4）。采用 Western blotting 检测 NRF2、CAT、HO-1 和 KEAP1 表达。*P < 0.05，ns：差异无统计学意义。数据以均值 ± SD 表示。P 值采用双尾非配对 Student t 检验计算（A–M）；或采用单因素方差分析并进行 Tukey 事后检验计算（N、O）。

GSH 是 Nogo-B/SLC7A11 抗钙化作用的重要下游环节

随后，研究者进一步评估 GSH 在 Nogo-B 和 SLC7A11 调控血管钙化中的贡献。丁硫氨酸亚砜亚胺（buthionine sulfoximine，BSO）是一种强效 GSH 合成抑制剂，可用于在 Nogo-B 过表达背景下耗竭细胞内 GSH。茜素红 S 染色、钙含量测定和 Western blotting 分析一致显示，GSH 耗竭显著抵消了 Nogo-B 过表达的抗成骨分化作用。类似地，BSO 处理也取消了 SLC7A11 过表达的抗钙化作用。

N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）是一种可补充细胞内 GSH 水平的高效抗氧化前体。研究者在 Nogo-B 敲低条件下给予 NAC，发现 NAC 处理可显著减轻 Nogo-B 敲低诱导的成骨分化增强。同样，NAC 补充也可有效抑制 SLC7A11 敲低导致的促钙化效应，并逆转 SLC7A11 抑制剂 HG106 促进的成骨分化。这些结果说明，Nogo-B 通过调控 SLC7A11 增强 GSH 合成，从而调节氧化应激，并最终抑制 HASMCs 成骨分化。

图6：升高 ROS 水平会限制 Nogo-B 对 HASMCs 成骨分化的抑制作用。（A–C）HASMCs 在高磷条件下转染 pEGFP-C2 或 OE-Nogo-B，并给予或不给予 1 μM BSO 处理（n = 4）。（D–F）HASMCs 在高磷条件下转染 pCMV-HA 或 OE-SLC7A11，并给予或不给予 1 μM BSO 处理（n = 4）。（G–I）HASMCs 在高磷条件下转染 siNC 或 siNogo-B，并给予或不给予 2 μM NAC 处理（n = 4）。（J–L）HASMCs 在高磷条件下转染 siNC 或 siSLC7A11，并给予或不给予 2 μM NAC 处理（n = 4）。（M–O）HASMCs 在高磷条件下用 HG106 处理，并给予或不给予 2 μM NAC（n = 4）。采用茜素红 S 染色检测钙沉积（A、D、G、J、M）。采用试剂盒测定钙含量（B、E、H、K、N）。采用 Western blotting 检测 RUNX2 和 BMP2 表达（C、F、I、L、O）。*P < 0.05，ns：差异无统计学意义。数据以均值 ± SD 表示。P 值采用单因素方差分析并进行 Tukey 事后检验计算（B、C、E、F、H、I、K、L、N 和 O）。

Nogo-B 通过 NRF2 诱导的 SLC7A11 转录抑制 HASMCs 成骨分化

既往研究表明，NRF2 是氧化应激反应中的核心转录因子，可在抗氧化通路中调控 SLC7A11。研究者也发现 Nogo-B 可在转录水平提高 SLC7A11 表达。因此，作者推测 NRF2 可能参与 Nogo-B 调控 SLC7A11 表达的过程。为验证 Nogo-B 是否通过 NRF2 在转录水平启动 SLC7A11 表达，研究者检索 UCSC 和 JASPAR 数据库，并在 SLC7A11 启动子区域发现一个由 NRF2 调控的抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE，位置为 -455 至 -446）。随后，通过 HASMCs 和人主动脉壁中的染色质免疫沉淀（ChIP）实验，作者发现 Nogo-B 过表达显著增强 NRF2 与 SLC7A11 启动子区域的结合富集。这些数据提示，Nogo-B 确实可通过 NRF2 在转录水平促进 SLC7A11 表达。免疫荧光检测显示，在平滑肌特异性 Nogo 敲除小鼠主动脉组织中，NRF2 核转位显著减少；相反，在离体培养的人主动脉壁中，Nogo-B 过表达可增加核内 NRF2。

为了验证 NRF2/SLC7A11/GSH 正反馈环的可靠性，研究者使用 BSO 耗竭 GSH，并检测 NRF2 转录活性或核转位。免疫荧光结果显示，Nogo-B 过表达可显著促进 NRF2 核转位，而 BSO 可明显阻断这一过程，使核内 NRF2 荧光信号显著降低。ChIP-qPCR 和 ChIP-PCR 结果进一步证实，BSO 处理可显著逆转 Nogo-B 诱导的 NRF2 在 SLC7A11 启动子区域结合富集增强。

接下来，研究者探索 NRF2 是否参与 Nogo-B 调控钙化的过程。作者使用 NRF2 特异性 siRNA 在 HASMCs 中敲低 NRF2 表达。结果显示，NRF2 敲低显著降低 SLC7A11 mRNA 水平。DCFH-DA、DHE 和 MitoSO™ Red 探针检测以及 GSH 测定显示，siRNA 介导的 NRF2 敲低显著增加 HASMCs 中 ROS 水平，并降低细胞内 GSH。进一步研究表明，NRF2 敲低明显下调 SLC7A11 表达，并通过茜素红 S 染色、钙定量、Western blotting 和 qPCR 分析证实其强烈促进 HASMCs 成骨分化。NAC 可阻断 siNRF2 加速的 HASMCs 成骨分化。

为了最终确认 NRF2 参与 Nogo-B-SLC7A11 调控轴，研究者在 Nogo-B 过表达条件下敲低 NRF2，结果发现 NRF2 敲低显著逆转 Nogo-B 过表达导致的成骨分化抑制，说明 Nogo-B 减轻血管钙化的作用依赖于 NRF2 活化增强。值得注意的是，SLC7A11 过表达可有效挽救 NRF2 敲低导致的钙化增加；GSH 含量测定也证实，SLC7A11 过表达可有效提高 GSH 水平。这表明 SLC7A11/GSH 是 Nogo-B 或 NRF2 减轻血管钙化的关键下游效应分子。

图7：Nogo-B 通过 NRF2 介导的 SLC7A11 正反馈调控抑制 HASMCs 成骨分化。（A）人 SLC7A11 启动子构建体及 SLC7A11 启动子中 NRF2 ARE 序列。（B、C）HASMCs 转染空载体或 GFP-Nogo-B 质粒，并在 CM 条件下培养 4 天。提取核蛋白并进行超声破碎，随后使用免疫球蛋白 G（IgG）或抗 NRF2 抗体进行染色质免疫沉淀（ChIP），并进行 PCR（B）和 qPCR（C）分析（n = 4）。（D–H）HASMCs 转染 siNC 或 siNRF2，并在 CM 中培养 4 天（n = 6）。采用 GSH 检测试剂盒测定 GSH 水平（D）。采用 MitoSO™ Red 荧光探针检测线粒体超氧水平（E）。采用茜素红 S 染色检测钙化（F）。采用试剂盒测定钙含量（G）。采用 Western blotting 检测 NRF2、SLC7A11、RUNX2 和 BMP2 表达（H）。（I、J）HASMCs 转染 siNC 或 siNRF2，并给予或不给予 2 μM NAC 处理，在 CM 中培养 4 天（n = 4）。采用茜素红 S 染色（I）和钙含量测定（J）检测钙化。（K–P）HASMCs 同时转染 siNC 或 siNRF2，以及 pEGFP-C2/OE-Nogo-B 或 pCMV-HA/OE-SLC7A11，并在 CM 中培养 4 天（n = 4）。采用茜素红 S 染色（K、N）和钙含量测定（L、O）检测钙化。采用 Western blotting 分析 RUNX2 和 BMP2 蛋白表达（M、P）。*P < 0.05，ns：差异无统计学意义。数据以均值 ± SD 表示。P 值采用双尾非配对 Student t 检验计算（B–E、G 和 H）；采用单因素方差分析并进行 Tukey 事后检验计算（J、L、M、O 和 P）。

【贡献】★★★★★

本研究确定内质网蛋白 Nogo-B 是 VSMCs 成骨分化和血管钙化的新型抑制因子。Nogo-B 可通过转录激活和转录后去泛素化两条途径稳定 SLC7A11 蛋白水平，从而保障 GSH 持续合成，并及时清除过量 ROS。充足 GSH 所维持的低氧化应激微环境进一步使 NRF2 处于活化状态，持续驱动 SLC7A11 表达，使细胞保持较强的抗氧化防御稳态。上述发现提示，Nogo-B 可能是血管钙化治疗的潜在靶点。

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