1区top：甘肃中医药大学揭示清肺通络方通过恢复花生四烯酸代谢平衡减轻慢性阻塞性肺疾病相关性铁死亡

【写在前面】：本期推荐的是由甘肃中医药大学敦煌医学教育部重点实验室、甘肃大学分子医学与中医药重大疾病防治重点实验室-甘肃中医药大学、敦煌医学甘肃基础学科研究中心、甘肃中医药大学药学院等研究团队合作近期发表于Phytomedicine(IF8.3）的一篇文章，揭示清清肺通络方通过前列腺素内过氧化物合酶2和可溶性环氧化物水解酶2的双重抑制恢复花生四烯酸代谢平衡，减轻慢性阻塞性肺疾病相关性铁死亡。

【期刊简介】

【题目及作者信息】

Qingfei Tongluo Formula attenuates COPD-associated ferroptosis by restoring arachidonic acid metabolic balance via dual inhibition of prostaglandin-endoperoxide synthase 2 and soluble epoxide hydrolase 2

背景

由于缺乏改变其疾病进展的疗法，慢性阻塞性肺疾病（COPD）仍然是一项重大的全球健康挑战。清肺通络方QFTLF是一种经典的中药方剂，对慢性阻塞性肺疾病有疗效。然而，其具体的分子机制和活性化合物仍未明确。

目的

本研究旨在破译QFTLF抗COPD的多靶点机制，并系统鉴定其关键的生物活性血清化合物。

方法

基于COPD大鼠模型的药效学评估和基于UPLC-MS/MS的QFTLF原型血清化合物的鉴定，我们进行了综合多模式分析，结合转录组学、蛋白质组学、基于PS-V2N的复杂网络和单细胞RNA测序，以确定原型血清化合物调节的核心靶点、途径和细胞类型。关键发现通过体内和体外实验得到了进一步验证。为了识别关键的生物活性血清化合物，我们采用了计算机辅助药物设计（CADD）管道，包括诱导配合对接、分子动力学模拟和结合自由能计算，随后通过表面等离子体共振（SPR）进行实验确认。

结果

药效学评价表明，QFTLF显著改善了COPD大鼠的肺功能、肺组织病理学和全身炎症，疗效与经典疗法氨茶碱相当。UPLC-MS/MS分析鉴定出58种原型血清化合物。多模态分析和验证表明，QFTLF在COPD大鼠肺组织和CSE诱导的MLE-12细胞中下调前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）和可溶性环氧化物水解酶2（EPHX2），同时上调CYP2J2。该调节恢复了花生四烯酸代谢平衡，增加了抗炎和抗氧化代谢产物11,12-EET，减少了促炎和促氧化代谢产物11,22-DHET。因此，QFTLF抑制了下游的致病指标，包括促炎细胞因子水平（TNF-α、IL-1β、IL-6）、脂质过氧化指标（GSH和T-SOD降低，MDA升高）和铁中毒指标（Fe²⁺ 积累、HMGB1释放和GPX4下调）。这种作用是通过抑制PTGS2-PPARγ-CYP2J2和EPHX2介导的途径介导的。值得注意的是，在CSE诱导的MLE-12细胞中，特异性PTGS2和EPHX2抑制剂的保护作用与QFTLF的保护作用非常相似，为这些靶点的参与提供了进一步的支持。此外，CADD和SPR鉴定并验证了7种具有高结合亲和力的关键血清化合物：4种用于PTGS2（牡丹皮苷C、黄芩苷、牡荆苷、芦荟素-8-O-β-d-吡喃葡萄糖苷），5种用于EPHX2（金缕梅单宁、Choerospondin、牡荆素、Nepitrin、芦荟素8-O-β-d-葡萄糖苷）。

结论

我们的研究结果表明，QFTLF是PTGS2/EPHX2的一种新型天然双重抑制剂，它通过恢复花生四烯酸代谢平衡来减轻肺上皮细胞（COPD损伤的主要部位）中与COPD相关的铁下垂，从而通过将QFTLF及其关键化合物定位为有希望的疾病修饰候选者来解决COPD中尚未满足的关键临床需求。

图文摘要

【前言】

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种进行性肺部疾病，其特征是持续的气流限制和呼吸道症状。在全球范围内，与慢性阻塞性肺病相关的残疾率和死亡率都在继续上升，随着人口老龄化，其患病率预计将进一步增加，给公共卫生带来越来越大的负担。主要病因涉及接触有害气体和颗粒物，特别是香烟烟雾（CS），这会导致渐进性炎症、肺泡损伤（肺气肿）和小气道阻塞性变化，如粘液堵塞，最终导致不可逆的气流阻塞、气道阻力升高和肺功能受损。环境因素，包括极端温度和聚氯乙烯（PVC）产品中的邻苯二甲酸酯（PAE），也被认为是导致症状恶化和疾病进展的因素。这种复杂的发病机制，再加上慢性阻塞性肺病的临床异质性，对开发广泛有效的疗法提出了重大挑战。目前的治疗依赖于长效支气管扩张剂（LABA/LAMAs）和吸入性糖皮质激素（ICSs），它们可以缓解症状，但不能阻止疾病进展或逆转潜在损伤。因此，迫切需要针对驱动慢性阻塞性肺病的核心分子机制的创新治疗方法。

许多研究证实，花生四烯酸（AA）代谢失调导致炎症、脂质过氧化和铁下垂，与慢性阻塞性肺病的发病机制密切相关。在AA代谢途径中，AA可以通过多种酶途径代谢，包括环氧化酶（COX）、脂氧合酶（LOX）和细胞色素P450（CYP），以产生各种二十烷类化合物。最近的研究进一步阐明了关键酶在这一途径中的作用。除了其经典的促炎功能外，前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2/COX-2）现在被认为是铁中毒的关键调节因子，通过特定的信号轴（如PTGS2-PGE2、NF-κB-PTGS2和PTGS2-AKR1C3-GPX4）积极促进脂质过氧化。12/15-LOX也被报道为脂质过氧化和铁中毒的关键调节因子。值得注意的是，来源于CYP介导的AA代谢（例如，通过CYP2J2）的抗炎和抗氧化环氧二十碳三烯酸（EET）可以被可溶性环氧化物水解酶（EPHX2/sEH）快速代谢为相应的促炎和促氧化二羟基二十碳三烯酸（DHET），从而加剧脂质过氧化并促进铁死亡信号传导。这些关键酶（PTGS2、12/15-LOX、CYP2J2和EPHX2）已被确定为COPD的有前景的治疗靶点。

然而，目前针对慢性阻塞性肺病的植物药物研究主要集中在PTGS2和12/15-LOX的双重抑制上，补肺活血胶囊和桑叶提取物的疗效证明了这一点。相比之下，目前还没有同时靶向PTGS2和EPHX2的植物药物。针对PTGS2和EPHX2的合成双抑制剂，如PTUPB，在肺部疾病中显示出有希望的结果。例如，据报道，PTUPB可以抑制巨噬细胞活化并下调炎症相关基因，从而减轻急性肺损伤和COPD进展。此外，PTGS2和EPHX2的双重抑制显著降低了博莱霉素诱导的肺泡上皮细胞（AECs）中衰老相关分子的表达。然而，单一合成化合物的副作用风险和潜在的药代动力学局限性不容忽视。此外，尚不清楚这种双靶点抑制策略是否在肺上皮细胞中具有类似的保护作用，肺上皮细胞是慢性阻塞性肺病的主要损伤部位。

中医药的多成分、多靶点方法为慢性阻塞性肺病等复杂呼吸道疾病提供了一种有前景的治疗策略。清肺通络方（QFTLF）来源于麻杏石甘汤，这是一种治疗呼吸道感染的经典中草药配方。最近，QFTLF因其对呼吸系统的显著疗效而被用于治疗COPD。此外，临床研究表明，QFTLF显著缓解了严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型感染患者的咳嗽和咳痰等症状，缓解率约为89%。这些发现强调了QFTLF作为COPD患者治疗选择的潜力。然而，QFTLF对COPD发挥治疗作用的多靶点机制和生物活性成分，特别是其在调节PTGS2和EPHX2中的作用，尚未得到探索，从而阻碍了对其治疗潜力的深入了解。

因此，为了阐明QFTLF的分子机制和生物活性成分，特别是其对PTGS2/EPHX2的双重调节，并研究这种双靶点抑制策略在缓解COPD相关炎症和铁下垂方面是否比单靶点干预更有效，我们采用了一种综合方法。这包括基于UPLC-MS/MS的血清药物化学、多模式数据整合分析（转录组学、蛋白质组学、基于PS-V2N的复杂网络和单细胞RNA测序）、CADD（诱导适配对接和MD模拟等）、SPR和体内/体外实验验证。我们的研究结果阐明，PTGS2/EPHX2的双重抑制对COPD肺上皮细胞具有保护作用。此外，QFTLF是一种新型的天然PTGS2/EPHX2双重抑制剂，在恢复花生四烯酸代谢平衡方面表现出卓越的多组分和多靶点疗效，从而减轻慢性阻塞性肺病相关的铁中毒、炎症和脂质过氧化。值得注意的是，七种血清化合物构成了这一活性的关键物质基础，Vitexin和Aloe-modin-8-O-β-d-吡喃葡萄糖苷显示出作为PTGS2/EPHX2双重抑制剂的特定潜力。总的来说，这些发现为开发同时靶向PTGS2/EPHX2的植物药物或药物组合提供了战略基础，并促进了QFTLF在COPD中的临床应用，这将是对GOLD指南的有益补充。

【结果部分】

1.通过UPLC-MS/MS对清肺通络方进行化学表征、质量标志物含量测定。

2.QFTLF减轻了脂多糖（LPS）和香烟烟雾（CS）诱导的大鼠COPD相关病理变化。

3.QFTLF衍生的原型血清化合物的鉴定。

4.转录组学和蛋白质组学分析揭示了QFTLF抗COPD的潜在机制。

5.多模态数据整合揭示了与QFTLF原型血清化合物相关的核心途径和靶点。

6.单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析验证了人类慢性阻塞性肺病的核心途径和靶点，并确定了关键细胞类型。

7.QFTLF对COPD保护作用的花生四烯酸代谢相关机制的体内验证。

8.不同细胞类型中香烟烟雾提取物（CSE）和QFTLF血清最佳暴露条件的确定。

9.QFTLF血清对CSE暴露的MLE-12细胞花生四烯酸代谢调节作用的体外验证。

10.QFTLF血清和PTGS2/EPHX2抑制剂对CSE暴露的MLE-12细胞铁死亡、脂质过氧化和炎症的影响。

11.关键PTGS2/EPHX2靶向化合物的计算鉴定和验证。

12.关键PTGS2和EPHX2靶向化合物的实验验证和机理分析。

13.QFTLF及其PTGS2/EPHX2靶向抗COPD活性化合物的示意图。

【结论与讨论】

总的来说，通过整合多模式数据，本研究创新性地证明了QFTLF是PTGS2和EPHX2的天然双重抑制剂，通过恢复花生四烯酸代谢平衡来减轻肺上皮细胞中与COPD相关的铁死亡。这些发现为系统地破译复杂草药配方的物质基础和机制建立了一个方法框架，同时也为开发新型双靶点药物提供了基础。最终，通过将QFTLF及其关键化合物定位为疾病修饰候选物，这项工作为GOPD指南提供了有益的补充。

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