Phytomedicine (1区，IF=11.3)｜丹酚酸B共价修饰Keap1关键半胱氨酸，激活Nrf2缓解药物性肝损伤（季莉莉/葛广波/黄镇林—上海...

2026年6月11日，上海中医药大学季莉莉、葛广波、黄镇林团队等，联合亳州学院、上海中医药国际标准化研究院等单位，在Phytomedicine（中科院1区，TOP期刊，IF=11.3）在线发表题为“Salvianolic acid B attenuates drug-induced liver injury in an Nrf2-dependent mechanism via covalently modifying Keap1 at Cys395/Cys434”的研究论文。该文于2026年2月15日投稿，2026年5月29日修回，2026年6月8日接收。

研究发现，丹参来源多酚类成分丹酚酸B（Sal B）可通过共价修饰Keap1的Cys395和Cys434，削弱Keap1-Nrf2相互作用，促进核因子E2相关因子2（Nrf2）抗氧化防御通路激活，从而在药物性肝损伤（DILI）模型中发挥肝保护作用。值得关注的是，该研究首次提出Keap1 Cys395是调控Nrf2活化的关键新型半胱氨酸修饰位点，为从天然产物中开发DILI干预候选物提供了新的机制依据。

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【摘 要】

背景：药物性肝损伤（DILI）是全球性健康问题，目前治疗选择仍然有限。核因子E2相关因子2（Nrf2）信号通路在抵御DILI中发挥关键作用，因此被认为是潜在治疗靶点。

目的：本研究旨在探讨丹参（Salvia miltiorrhiza Bge.）来源多酚类化合物丹酚酸B（Sal B）对DILI的肝保护作用，并阐明其潜在分子机制，重点关注Nrf2通路。

方法：研究首先通过化合物筛选确定Sal B是一种强效Nrf2激活剂。随后采用细胞热转变实验（CETSA）、表面等离子体共振（SPR）和微量热泳动（MST）检测Sal B与Nrf2抑制蛋白Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）之间的直接相互作用。研究进一步利用Nrf2敲除（Nrf2-/-）小鼠和肝脏特异性Keap1敲除（Hepcre-Keap1flox/flox）小鼠，评估Nrf2和Keap1在Sal B介导肝保护作用中的功能。基于质谱的化学蛋白质组学分析和突变实验用于鉴定Sal B修饰的特定半胱氨酸残基。分子动力学模拟用于分析Sal B结合后Keap1构象的变化。

结果：Sal B能够强烈激活Nrf2，而Nrf2敲除显著削弱其肝保护作用。Sal B可直接结合Keap1。在Hepcre-Keap1flox/flox小鼠中，DILI本身得到缓解，同时Sal B的保护作用也被削弱。进一步研究显示，Sal B可共价修饰Keap1双甘氨酸重复（DGR）结构域内的Cys395和Cys434。突变这些残基会削弱Sal B-Keap1相互作用，并消除Nrf2激活。Sal B的修饰改变了Keap1 Kelch结构域构象，使Nrf2结合口袋变得松散，从而促进Nrf2激活。

结论：Sal B通过共价修饰Keap1的Cys395和Cys434激活Nrf2，从而对DILI发挥肝保护作用。这些发现为Sal B作为DILI潜在新型治疗候选物提供了机制依据。

01

研究背景及科学问题

药物性肝损伤（DILI）是指由药物及其代谢产物引起的肝毒性反应，严重时可进展为急性肝衰竭（ALF）。全球每年DILI发病率约为每百万人49.4例，其中亚洲发病率最高，约为每百万人178.2例。在西方国家，对乙酰氨基酚（APAP）和抗菌药物是DILI的主要原因，其中APAP约占美国ALF病例的39%。相比之下，在东方地区，草药和抗结核治疗是DILI的重要诱因之一，这在一定程度上与草药在许多亚洲国家医疗体系中的重要地位有关。在中国，草药性肝损伤约占DILI病例的27%。值得注意的是，在一些西方国家，如美国、冰岛和西班牙，草药补充剂使用较为普遍，草药性肝损伤同样在DILI病因中占据较高比例。因此，由药物和草药共同导致的肝损伤已成为全球重要公共卫生问题。

激活细胞内抗氧化系统已成为DILI治疗中较为公认的策略。例如，N-乙酰半胱氨酸（NAC）是还原型谷胱甘肽（GSH）合成的前体，也是APAP中毒的主要治疗药物。Nrf2是细胞抗氧化应答的关键调控因子。Nrf2-ECH同源结构域（Neh）1–7是Nrf2的主要功能区域，其中Neh2含有与Keap1结合的位点。Keap1是Nrf2的主要抑制蛋白，可募集Cullin 3泛素E3连接酶复合物至Neh2结构域，促进Nrf2泛素化和降解。Keap1主要包含三个结构域：N端BTB结构域，可募集Cullin 3；中央IVR区域，可稳定Nrf2结合；以及C端双甘氨酸重复（DGR）结构域，可与Neh2区域相互作用。破坏Keap1-Nrf2相互作用能够促进Nrf2激活，因此被认为是缓解氧化应激并减轻DILI的有效策略。

半胱氨酸（Cys）残基含有巯基（-SH），具有高度亲核性，因而特别容易与亲电性配体发生反应。这种内在反应活性使其能够发生共价修饰，并深刻影响蛋白质结构和功能。在Keap1中，特定半胱氨酸残基的共价修饰可破坏其与Nrf2的相互作用，导致Nrf2稳定和激活。其中，Cys151是目前研究最充分的位点。靶向Cys151的小分子，如富马酸二甲酯和omaveloxolone，已分别在多发性硬化症和弗里德赖希共济失调治疗中取得临床成功。然而，Keap1共含有27个半胱氨酸残基，其中许多位点仍缺乏充分研究。系统探索这些较少被关注的半胱氨酸残基，有助于深化对Keap1-Nrf2相互作用的基础认识，并促进新型Nrf2激活剂发现，从而推动氧化应激相关疾病治疗策略的发展。

丹酚酸B（Sal B）是从丹参中分离得到的多酚类化合物。既往研究提示，Sal B可通过激活Nrf2介导的抗氧化信号通路，缓解皮肤衰老、创伤性脑损伤和化疗诱导的心脏毒性等多种疾病。基于其优良的抗氧化活性，Sal B也显示出治疗DILI的潜力。本研究发现，Sal B可在体内和体外减轻DILI。进一步机制研究表明，Sal B可共价修饰Keap1上的半胱氨酸残基，尤其是Cys395和Cys434，从而破坏Keap1-Nrf2相互作用。值得注意的是，本研究首次报道Keap1 Cys395的共价修饰。这一共价修饰促进Nrf2激活，最终参与Sal B抵抗DILI的肝保护作用。

02

重要发现及亮点

Nrf2在DILI中的关键作用与Sal B候选物发现

根据引起DILI的潜力，当前FDA批准药物可被划分为撤市、黑框警告、警告和注意事项、不良反应四类。本研究选择了两种具有代表性的肝毒性药物进行后续研究：甲氨蝶呤（MTX，黑框警告）和对乙酰氨基酚（APAP，警告和注意事项）。为探索草药性肝损伤，研究还选择了三种代表性草药来源毒性化合物：千里光宁碱（SENE，来源于菊三七Gynura japonica或千里光Senecio scandens）、川楝素（TSN，来源于川楝Melia toosendan）和雷公藤多苷（TWM/TWN，来源于雷公藤Tripterygium wilfordii）。

研究者从GeneCards人类基因组数据库中筛选DILI相关基因，并进一步利用Metascape数据库进行分析。富集分析显示，“对氧水平的反应”和“活性氧（ROS）”等生物过程显著参与DILI。关键基因分析显示，Nrf2是DILI中的核心分子，在10,172个基因中排名第39位。进一步对APAP、MTX和TWN诱导肝损伤的基因表达数据进行分析，也证实Nrf2始终处于较高排名。这些结果共同提示，Nrf2在DILI发生机制中具有关键作用。

由于多数多酚类化合物能够激活Nrf2，研究者进一步通过分子对接筛选120种天然多酚与Keap1的结合能力。结果显示，Sal B与Keap1的结合亲和力最高。荧光素酶报告实验进一步证明，Sal B可诱导Nrf2转录激活，有效浓度低于20 μM。随后，研究者选取在分子对接和荧光素酶实验中均呈阳性的11种多酚，在APAP处理的肝细胞中继续验证。结果显示，Sal B能够显著逆转APAP导致的细胞活力下降。整体来看，Sal B具有激活Nrf2并缓解DILI的潜力。

图1：Nrf2在DILI中的关键作用及Sal B作为靶向治疗候选物的发现。（A）代表性药物性毒性药物和草药来源毒性化合物。（B）基于GeneCards数据集（药物性肝损伤，DILI）的Metascape通路富集分析。（C）DILI相关基因符号散点图。（D）用于高通量筛选的多酚类化合物与Keap1对接评分图。（E）多酚类化合物对接值与转录激活浓度的散点图。Sal B被标记为高度有前景的候选化合物。黑色三角形代表Sal B，红色三角形表示转录激活浓度＜20 μM，蓝色三角形表示转录激活浓度＞20 μM。（F）细胞活力检测。数据以均值±SEM表示（n = 6）。**p<0.01，与对照组相比；<0.05，#<0.01，与APAP组相比。

Nrf2是Sal B抵抗多种肝毒性药物损伤的重要基础

为评估Nrf2在Sal B介导DILI保护中的关键作用，研究者分离Nrf2+/+或Nrf2-/-小鼠原代肝细胞，并分别使用两种代表性肝毒性药物APAP、MTX，以及三种天然肝毒性化合物SENE、TSN和TWN处理，随后与Sal B共同孵育。

在Nrf2+/+原代肝细胞中，Sal B显著提高了APAP、TSN、SENE或TWN降低的细胞活力。然而，在Nrf2-/-原代肝细胞中，Sal B无法恢复APAP、TSN、SENE或TWN导致的细胞活力下降。对于MTX诱导的细胞活力降低，Sal B在Nrf2+/+原代肝细胞中同样具有逆转作用，但在Nrf2-/-原代肝细胞中这一保护作用减弱。

ROS检测结果显示，在Nrf2+/+原代肝细胞中，Sal B可有效降低上述五种肝毒性物质诱导升高的细胞ROS水平。然而，在Nrf2-/-原代肝细胞中，Sal B降低TSN诱导ROS升高的作用完全消失，对APAP、TWN和MTX诱导ROS升高的抑制作用也明显减弱。这些结果表明，Nrf2在抵御DILI中发挥重要作用。在所测试的五种肝毒性物质中，Nrf2对Sal B抵抗APAP和TSN诱导肝毒性尤其关键。因此，后续研究选择APAP和TSN作为重点模型。

图2：Nrf2是Sal B抵抗肝毒性药物保护作用所必需的。分离自Nrf2+/+或Nrf2-/-小鼠的原代肝细胞经Sal B（10 μM和25 μM）及不同肝毒性物质处理后，检测细胞活力（左图）和ROS水平（右图）。（A）APAP（7.5 mM）。（B）TSN（500 μM）。（C）SENE（50 μM）。（D）TWN（5 μg/ml）。（E）MTX（250 μM）。数据以均值±SEM表示（n = 3）。*p<0.05，与对照组相比；<0.05，与肝毒性物质处理组相比；&p<0.05，&&p<0.01，与Nrf2+/+组相比。

Sal B缓解APAP和TSN诱导肝损伤依赖Nrf2

在动物实验中，APAP或TSN显著升高Nrf2+/+小鼠血清ALT/AST活性，而Sal B能够明显降低这些升高的肝损伤指标。然而，在APAP处理的Nrf2-/-小鼠中，Sal B的这一作用完全消失；在TSN处理的Nrf2-/-小鼠中，其作用也显著减弱。同时，Nrf2-/-小鼠中由APAP或TSN引起的ALT/AST升高进一步加重。

组织学观察显示，在Nrf2+/+小鼠中，Sal B可缓解APAP诱导的肝细胞核固缩和坏死，以及TSN诱导的肝细胞肿胀。相比之下，在Nrf2-/-小鼠中，APAP诱导更严重的肝细胞坏死，TSN导致更大范围的肝细胞肿胀，并且Sal B改善这些病变的作用完全消失。进一步检测发现，Sal B可显著降低Nrf2+/+小鼠肝脏中APAP和TSN诱导升高的ROS水平，但这一作用在Nrf2-/-小鼠中完全消失。Sal B还可逆转APAP或TSN处理后Nrf2+/+小鼠肝脏GSH含量下降；但在APAP处理的Nrf2-/-小鼠中，Sal B无法恢复GSH含量，在TSN处理的Nrf2-/-小鼠中也仅轻微升高GSH。上述结果说明，Sal B对APAP和TSN诱导肝毒性的保护作用依赖Nrf2。

图3：Sal B对APAP和TSN诱导肝损伤的保护作用依赖Nrf2。APAP诱导肝损伤：（A-B）血清ALT和AST。（C）肝脏组织学评估。显示各实验组代表性图像。比例尺：50、100 μm。（D）肝脏ROS水平。（E）肝脏GSH水平。TSN诱导肝损伤：（F-G）血清ALT和AST。（H）肝脏组织学评估。显示各实验组代表性图像。比例尺：50、100 μm。（I）肝脏ROS水平。（J）肝脏GSH水平。数据以均值±SEM表示（n = 3–5）。*p<0.05，***p<0.001，与对照组相比；<0.05，#<0.01，##<0.001，与APAP或TSN组相比；&p<0.05，&&p<0.01，&&&p<0.001，与Nrf2+/+组相比。

Sal B通过直接结合Keap1诱导Nrf2活化

动物实验显示，在APAP或TSN处理小鼠肝脏中，Sal B促进Nrf2核转位，并增强肝脏Gclc和Gclm mRNA表达。体外实验同样证实，Sal B可在APAP或TSN处理的HepaRG肝细胞中激活Nrf2抗氧化信号轴。

随后，研究者进一步探索Sal B激活Nrf2的机制。CETSA结果显示，Sal B处理后Keap1热稳定性增强，提示Sal B可能与Keap1结合。SPR分析显示，Sal B与Keap1具有较强结合亲和力，平衡解离常数KD为4.171 μM。MST检测进一步证实Sal B与Keap1之间存在相互作用，解离常数Kd约为14.6 μM。Pull-down实验显示，Sal B偶联磁珠能够显著拉下Keap1蛋白，而游离Sal B可削弱这一作用。此外，Co-IP实验显示，Sal B显著降低APAP和TSN处理小鼠肝脏中Keap1-Nrf2相互作用。综合来看，Sal B通过直接与Keap1相互作用激活Nrf2。

图4：Sal B通过直接结合Keap1诱导Nrf2活化。（A-B）核Nrf2蛋白水平的代表性蛋白条带及定量分析，Lamin B1作为上样内参。（C）CETSA实验。（D）SPR检测。（E）MST检测。（F）用于pull-down实验的Sal B偶联磁珠构建示意图（左图）；Sal B偶联磁珠拉下的Keap1蛋白（中图和右图）。数据以均值±SEM表示（n = 3）。*p<0.05，与对照组或Sal B组相比；<0.05，与APAP或TSN组相比。

肝脏特异性Keap1敲除削弱Sal B对DILI的保护作用

为验证Keap1是否是Sal B抵抗DILI的作用靶点，研究者使用肝脏特异性Keap1敲除小鼠开展实验。APAP和TSN均可显著升高Keap1flox/flox小鼠和Hepcre-Keap1flox/flox小鼠血清ALT/AST活性。然而，与Keap1flox/flox小鼠相比，Hepcre-Keap1flox/flox小鼠ALT/AST升高幅度明显较低。Sal B可显著降低Keap1flox/flox小鼠中APAP或TSN诱导升高的ALT/AST活性；但在Hepcre-Keap1flox/flox小鼠中，Sal B在APAP处理条件下不能降低这些指标，在TSN处理条件下也仅轻度降低。

组织学结果显示，与Keap1flox/flox小鼠相比，APAP或TSN诱导的肝细胞肿胀和细胞核固缩在Hepcre-Keap1flox/flox小鼠中明显减轻。Sal B可明显改善Keap1flox/flox和Hepcre-Keap1flox/flox小鼠中的APAP或TSN诱导肝细胞损伤，但在Hepcre-Keap1flox/flox小鼠中的改善幅度弱于Keap1flox/flox小鼠。

随后研究者检测肝脏氧化应激损伤。在Keap1flox/flox小鼠肝脏中，APAP和TSN均显著降低GSH含量并升高ROS水平，而Sal B可有效逆转这些变化。相比之下，在Hepcre-Keap1flox/flox小鼠中，APAP未导致肝脏GSH含量下降，Sal B也未进一步提高GSH水平。APAP或TSN诱导的肝脏ROS升高在Hepcre-Keap1flox/flox小鼠中较Keap1flox/flox小鼠更轻，Sal B降低ROS的效果也较弱。类似地，在TSN处理的Hepcre-Keap1flox/flox小鼠中，肝脏GSH水平较Keap1flox/flox小鼠更高，而Sal B仅诱导轻度升高。这些结果提示，Keap1是Sal B发挥Nrf2激活和肝保护作用的重要靶点。

图5：Sal B对APAP或TSN诱导肝损伤的作用在肝脏特异性Keap1敲除小鼠中的表现。APAP诱导肝损伤：（A-B）血清ALT和AST。（C）肝脏组织学评估。显示各实验组代表性图像。比例尺：50、100 μm。（D）肝脏ROS水平。（E）肝脏GSH水平。TSN诱导肝损伤：（F-G）血清ALT和AST。（H）肝脏组织学评估。显示各实验组代表性图像。比例尺：50、100 μm。（I）肝脏ROS水平。（J）肝脏GSH水平。数据以均值±SEM表示（n = 3–4）。*p<0.05，***p<0.001，与对照组相比；<0.05，##<0.001，与APAP或TSN组相比；&p<0.05，&&&p<0.001，与Keap1flox/flox组相比。

鉴定Sal B结合Keap1的关键半胱氨酸残基

为阐明Sal B与Keap1之间的共价结合机制，并确定关键修饰位点，研究者采用基于质谱的化学蛋白质组学分析，系统筛选潜在半胱氨酸残基。Sal B的特征性碎片离子被进一步解析。可能参与Sal B结合的候选半胱氨酸残基包括：位于BTB结构域的Cys77和Cys151，位于IVR结构域的Cys226、Cys249、Cys273、Cys288和Cys297，以及位于DGR结构域的Cys395、Cys434和Cys518。进一步分析中，IVR结构域被细分为IVR-V1和IVR-V2两个区域，分别包含Cys226/Cys249和Cys273/Cys288/Cys297。由于分子操作环境（MOE）软件预测Cys518与Sal B的共价结合亲和力相对较低，因此后续研究未纳入该位点。

基于上述发现，研究者构建了一系列Keap1质粒，用以评估不同结构域中半胱氨酸残基对Sal B结合的贡献。这些质粒包括全长Keap1，以及多个结构域特异性半胱氨酸突变体：BTB结构域Cys77和Cys151突变体（Keap1-CBTBA）、IVR结构域Cys226、Cys249、Cys273、Cys288和Cys297突变体（Keap1-CIVRA），以及DGR结构域Cys395和Cys434突变体（Keap1-CDGRA）。

随后，研究者将这些质粒转染至Keap1缺失Huh-7细胞，评估Sal B对Nrf2活化的影响。Sal B可显著提高转染全长Keap1细胞中的Nrf2蛋白水平。然而，在Keap1-CBTBA转染细胞中，这一升高轻度减弱；在表达Keap1-CIVRA或Keap1-CDGRA的细胞中，Sal B诱导的Nrf2升高完全消失，同时这些突变并不改变Keap1蛋白水平。MST进一步检测Sal B与这些GFP标记Keap1变体的结合亲和力，结果显示，Sal B与Keap1、Keap1-CBTBA、Keap1-CIVRA和Keap1-CDGRA结合的Kd值分别为9.52 μM、26.6 μM、56.86 μM和183.2 μM。综合来看，DGR结构域中的Cys395和Cys434是介导Sal B与Keap1共价相互作用的主要决定因素；IVR结构域中的Cys226、Cys249、Cys273、Cys288和Cys297发挥中等作用；BTB结构域中的Cys77和Cys151对Sal B结合Keap1的贡献较小。

图6：鉴定Sal B结合Keap1的关键半胱氨酸残基。（A）利用质谱和亲核取代反应鉴定Sal B在Keap1上结合位点的实验流程示意图。（B）Sal B与Keap1相互作用的化学结构、加合物分子式和结合位点。（C）Keap1结构模型，显示半胱氨酸残基，不同颜色突出显示。Sal B修饰的半胱氨酸残基被标出。（D）突变型Keap1质粒构建示意图。突变的半胱氨酸残基被标示。（E）Keap1缺失Huh-7细胞和表达Keap1的Huh-7细胞中的Keap1蛋白水平。（F）Keap1缺失Huh-7细胞转染不同Keap1突变体并经Sal B（10 μM）处理后，Nrf2和Keap1蛋白水平。右侧显示定量灰度分析。数据以均值±SEM表示（n = 3）。*p<0.05，与对照组相比；<0.05，#<0.01，与野生型Keap1相比。（G）MST结合曲线显示Sal B与Keap1，或Sal B与不同Keap1突变体之间的相互作用。每种相互作用的解离常数（Kd）列于右侧。

Sal B主要通过共价修饰Keap1 Cys395和Cys434激活Nrf2

由于DGR结构域Cys395/Cys434和IVR结构域Cys226、Cys249、Cys273、Cys288、Cys297的突变均会削弱Sal B诱导的Nrf2激活，研究者进一步解析这些位点的作用。随后构建GFP标记Keap1质粒，包括DGR结构域Cys395或Cys434突变体（分别命名为Keap1-C434A-GFP和Keap1-C395A-GFP）、IVR结构域Cys226/Cys249突变体（Keap1-CIVR-1A-GFP），以及IVR结构域Cys273/Cys288/Cys297突变体（Keap1-CIVR-2A-GFP）。

MST分析显示，Cys395或Cys434突变均显著降低Sal B与Keap1的结合亲和力，Kd值分别由9.52 μM升高至119.4 μM和154.9 μM。相比之下，Cys226/Cys249双突变和Cys273/Cys288/Cys297三突变仅中等程度降低结合亲和力，Kd值分别由9.52 μM升高至53.12 μM和28.8 μM。基于质谱的化学蛋白质组学分析进一步证实，Sal B及其片段可与Keap1肽段中的Cys395和Cys434发生共价结合。细胞活力实验显示，在转染空载体的细胞中，Sal B可有效恢复APAP或TSN降低的肝细胞存活率；但在转染全长Keap1的细胞中，这种保护作用完全消失。值得注意的是，在表达Cys395和Cys434被替换的Keap1-CDGRA突变体细胞中，这种“保护作用消失”又被逆转。上述结果提示，Sal B诱导的Cys395和Cys434共价修饰对于Sal B激活Nrf2并抵抗DILI具有重要意义。

研究者进一步采用分子动力学模拟，评估Sal B在Cys395、Cys434或二者同时修饰时Keap1 Kelch结构域构象变化。与未结合配体的apo状态相比，Cys395/Cys434双修饰使Kelch结构域回转半径（Rg）从1.804 nm升高至1.828 nm。Cys395单修饰使Rg升高至1.823 nm，而Cys434单修饰变化很小，为1.806 nm，接近apo状态。均方根波动（RMSF）分析显示，Sal B对Cys395和Cys434的修饰增加了Nrf2结合口袋附近氨基酸的柔性，如Arg336、Asp385、His516、Gln528和Gln563，从而导致该结合口袋结构松散。为进一步确认Keap1-Nrf2结合是否受到影响，研究者进行了集合对接分析。结果显示，Cys395/Cys434双修饰降低了Kelch结构域与Nrf2 ETGE基序的中位结合亲和力，并略微提高其与DLG基序的亲和力。Cys395单独修饰同时降低Kelch-ETGE和Kelch-DLG结合亲和力，而Cys434修饰则使两者亲和力轻度升高，提示相较于Cys434，Cys395在Sal B调控Nrf2-Keap1相互作用中更关键。

为从功能层面验证上述观察，研究者将编码全长Keap1、Keap1-CDGRA、Keap1-C395A或Keap1-C434A的质粒转染至Keap1缺失Huh-7细胞，并进行Sal B处理。结果显示，Cys434或Cys395单突变以及Cys434/Cys395双突变均可减弱Sal B增强Nrf2表达的作用，其中双突变影响最强，但这些突变并不改变Keap1表达。值得注意的是，Keap1-C395A质粒导致的Nrf2表达降低幅度大于Keap1-C434A质粒。与此一致，细胞活力实验显示，Sal B可保护肝细胞免受APAP和TSN诱导的肝毒性损伤，而转染全长Keap1会完全消除这种保护作用。Keap1-C395A转染可恢复Sal B的肝保护效应，而Keap1-C434A转染在TSN处理细胞中不能恢复，在APAP处理细胞中也仅部分恢复。整体而言，DGR结构域Cys395的共价修饰对Sal B诱导Nrf2激活和抵抗DILI的肝保护作用至关重要，Cys434也有贡献，但程度较低。

图7：Sal B通过共价修饰Keap1的Cys395和Cys434诱导Nrf2活化。（A）突变型Keap1质粒构建示意图。特定突变的半胱氨酸残基被标示。（B）MST结合曲线显示Sal B与Keap1，或Sal B与不同Keap1突变体（Keap1-C434A-GFP、Keap1-C395A-GFP、Keap1-CIVR-1A-GFP和Keap1-CIVR-2A-GFP）之间的相互作用。每种相互作用的解离常数（Kd）列于右侧。（C）Sal B修饰肽段的MS碎片谱图。（D）Keap1缺失Huh-7细胞经APAP或TSN处理后的细胞活力检测。（E）apo状态、Cys395修饰、Cys434修饰以及Cys395/434双修饰Kelch结构域的最大中心结构。Arg336、Asp385、Cys395、Cys434、His516、Gln528和Gln563以球形形式显示。（F）apo状态、Cys395修饰、Cys434修饰以及Cys395/434双修饰Kelch结构域的回转分析。（G）apo状态、Cys395修饰、Cys434修饰以及Cys395/434双修饰Kelch结构域的RMSF分析。具有明显RMSF变化的残基被标注。（H）ETGE/DLG基序与apo状态、Cys395修饰、Cys434修饰以及Cys395/434双修饰Kelch结构域之间的集合对接分析。（I）Keap1缺失Huh-7细胞转染不同Keap1突变体并经Sal B（10 μM）处理后，Nrf2和Keap1蛋白水平。右侧显示定量灰度分析。数据以均值±SEM表示（n = 3）。*p<0.05，与对照组相比；<0.05，与野生型Keap1相比；&p<0.05，与Keap1-CDGRA相比。（J）Keap1缺失Huh-7细胞经APAP或TSN处理后的细胞活力检测。数据以均值±SEM表示（n = 3）。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，与对照组相比；<0.05，#<0.01，##<0.001，与APAP或TSN组相比；&p<0.05，&&&p<0.001，与Vector组相比。

机制示意图总结

综合上述结果，Sal B可通过共价修饰Keap1的Cys395和Cys434，引起Keap1构象变化，削弱Keap1-Nrf2相互作用，从而促进Nrf2抗氧化防御系统激活。该机制最终参与Sal B对APAP和TSN诱导DILI的保护作用。

图8：Sal B通过共价修饰Keap1的Cys395和Cys434诱导Keap1构象变化，进而激活Nrf2，从而缓解DILI的机制示意图。

【贡献】★★★★★

本研究表明，Sal B能够以Keap1/Nrf2依赖性方式有效缓解APAP和TSN诱导的肝损伤。进一步机制研究发现，Sal B可共价修饰Keap1的Cys395和Cys434残基，从而破坏Keap1-Nrf2相互作用，并最终激活Nrf2抗氧化防御系统。重要的是，研究鉴定Cys395是一个对Nrf2激活具有关键意义的新型半胱氨酸修饰位点。这些发现提示，Sal B在DILI临床管理中具有潜在治疗开发价值。

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