Acta Pharm Sin B (IF=14.6)｜靶向脓毒症炎症新靶点DNAJC9：丹参酮共价衍生物A12调控HSP70–NF-κB轴！(柳红/唐炜...

2026年6月18日，中国科学院上海药物研究所柳红、唐炜、周虎、王江、周晨等团队，联合南京中医药大学、上海科技大学、安徽医科大学等单位，在Acta Pharmaceutica Sinica B（中科院1区，IF=14.6）发表题为 “Discovery of a potent covalent inhibitor for the treatment of sepsis targeting DNAJC9: Identification of a druggable target for inflammation” 的研究论文。该文于2026年1月30日收稿，2026年6月9日修回，2026年6月18日接收。

该研究围绕脓毒症相关急性全身炎症缺乏特异性药物治疗这一问题，从天然产物丹参酮 IIA 出发，引入共价弹头进行结构改造，发现了具有较强抗炎活性的丹参酮共价衍生物 A12。研究显示，A12 在脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞炎症模型和小鼠内毒素血症模型中，均可降低 TNF-α、IL-6、IL-12 等促炎因子水平。机制上，A12 可共价结合 DNAJC9，影响 HSP 复合体，并进一步抑制 NF-κB 相关炎症反应。该研究提出 DNAJC9 可能是炎症调控中的一个新型可成药靶点，也为脓毒症相关急性系统性炎症干预提供了新的候选分子和机制线索。

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【摘 要】

脓毒症是重症监护病房（ICU）患者死亡的重要原因之一，目前临床上仍缺乏针对脓毒症的特异性治疗药物。本研究报道了一种含有共价弹头的丹参酮衍生物 A12。该化合物在体外和体内均表现出较强的抗炎作用。

在脂多糖（LPS）诱导的小鼠内毒素血症和急性全身炎症模型中，A12 显著降低 TNF-α、IL-6 和 IL-12 水平。不同于现有抗炎小分子，A12 具有独特作用机制：它可共价结合 DNAJC9，从而调控热休克蛋白（HSP）复合体，并抑制下游炎症反应。

本研究首次将共价药物设计原则应用于天然产物丹参酮的结构改造，并揭示了 DNAJC9 在炎症疾病中此前未被认识的作用，为脓毒症相关急性全身炎症的干预提供了新的治疗靶点。

01

研究背景及科学问题

脓毒症是由宿主对感染反应失调所导致的器官功能障碍。全球每年约有 1800 万例新发脓毒症病例，死亡率约为 28%—40%；对于发生脓毒性休克的患者，死亡率更高，可达 50%—85%。因此，脓毒症是全球 ICU 患者死亡的主要原因之一。

尽管脓毒症发病率高、预后差，但目前临床上仍缺乏特异性药物治疗。脓毒症的发病机制尚未完全阐明，其中过度炎症反应是推动疾病进展的重要因素，可导致多器官功能障碍和组织损伤。因此，及时、合理地调节炎症反应，对于改善脓毒症患者结局具有重要意义。围绕炎症干预开发抗脓毒症药物，也可能为这一危重疾病带来新的治疗思路。

丹参酮 IIA 是中药丹参（Salvia miltiorrhiza）中含量最丰富的脂溶性成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤和抗动脉粥样硬化等多种药理活性，因此被认为是具有潜力的先导化合物。研究团队长期关注天然产物的结构改造与药理活性研究，并构建了具有多样骨架结构的丹参酮衍生物库。通过在 LPS 诱导的 RAW264.7 细胞中进行表型筛选，研究者发现了一系列能够有效降低 TNF-α 和 IL-6 分泌水平的抗炎丹参酮小分子。

进一步的构效关系研究发现，引入共价弹头后，化合物 A12 的抗炎活性显著增强。与原本较弱的抗炎活性相比，A12 的活性提升约 100 倍，达到亚微摩尔水平。此外，在 LPS 诱导的小鼠脓毒症样系统性急性炎症模型中，口服 A12 可显著降低促炎细胞因子 TNF-α、IL-6 和 IL-12 水平，从而有效抑制炎症反应。

天然产物药物发现中的一个重要挑战，是靶点探索与鉴定。鉴于 A12 在体内外均显示出良好的抗炎活性，研究者进一步开展了靶点发现研究。通过合理设计分子探针，研究者合成了两个阳性探针和一个阴性探针，快速识别出靶蛋白 DNAJC9，即 Dnaj 热休克蛋白家族（HSP40）成员 C9，并阐明了 A12 独特的抗炎机制。

研究进一步验证了 DNAJC9 在炎症中的作用，并提出 A12 可能通过与 DNAJC9 发生共价相互作用，影响 HSP 复合体，进而抑制下游炎症反应。由于 DNAJC9 是参与 HSP70 调控的重要辅助伴侣蛋白，A12 与 DNAJC9 的相互作用可能影响更广泛的 HSP70 分子伴侣系统。HSP70 分子伴侣系统在细胞蛋白稳态维持中发挥关键作用，并参与炎症反应调控。

HSP40，也称 Dnaj，是 HSP70 分子伴侣系统的重要组成部分，可通过刺激 ATP 水解调节 HSP70 蛋白功能。HSP70 在应激条件下大量产生，在维持蛋白稳态中具有核心作用。此外，细胞内 HSP70 还具有抗炎特性，可抑制 TNF-α、IL-12、IL-1 等细胞因子的产生及其促炎作用。

本研究报道了通过表型药物筛选发现的新型抗炎小分子共价抑制剂 A12。通过共价药物设计策略，研究者在 A12 的设计中引入共价弹头，使丹参酮 IIA 原本有限的抗炎活性提高约 100 倍。A12 在体外 LPS 诱导炎症模型和体内脓毒症小鼠系统性急性炎症模型中，均可显著降低 TNF-α 和 IL-6 的表达，并抑制细胞因子风暴相关反应。

更重要的是，研究者通过化学探针设计合成及化学蛋白质组学方法，发现 A12 通过抑制 Dnajc9 发挥抗炎作用。基因组学和蛋白质组学研究共同提示 Dnajc9 是一个新的抗炎靶点。后续分子生物学实验进一步阐明了其在炎症调控中的作用，为抗炎药物研发提供了新的方向。作者指出，这是首次报道 Dnajc9 在炎症发生和调控中的作用，为抗炎药物开发提供了新的靶点。

02

重要发现及亮点

引入共价弹头显著增强丹参酮 IIA 的抗炎活性

丹参酮 IIA 本身具有一定抗炎活性，但总体较弱，其对 IL-6 的 IC50 大于 30 μmol/L，对 TNF-α 的 IC50 大于 50 μmol/L。为了增强其抗炎活性，研究者在丹参酮 IIA 的 C1 位引入共价弹头，设计并合成了一系列新型丹参酮 IIA 衍生物。

研究团队利用 LPS 诱导的 RAW264.7 细胞模型，对这些化合物进行体外抗炎活性筛选。结果显示，共价修饰衍生物 A1–A12 对 IL-6 和 TNF-α 分泌均表现出明显抑制作用，其 IC50 分别为 0.67–4.51 μmol/L 和 0.87–13.21 μmol/L，明显优于丹参酮 IIA。

其中，含有（E）-4-（二甲基氨基）丁-2-烯酰胺末端共价弹头的衍生物 A12，体外抗炎活性最强：其对 IL-6 的 IC50 为 0.87 μmol/L，对 TNF-α 的 IC50 为 0.67 μmol/L。与对照药物丹参酮 IIA 和阿普米司特相比，A12 表现出更强效的活性，也验证了筛选平台的可靠性。

在体内转化潜力方面，药代动力学分析显示，A12 具有较好的口服生物利用度（10.7%）和系统暴露水平。为了验证结构改造是否转化为更好的治疗效果，研究者将 A12 与母体化合物丹参酮 IIA 进行了直接比较。结果显示，在预防性给药和治疗性给药模式下，口服 A12 对血清细胞因子的抑制作用均显著强于丹参酮 IIA。

组织学检查进一步证实，A12 可明显缓解 LPS 诱导的肺泡壁增厚和肠黏膜损伤。在 10 mg/kg 剂量下，口服 A12 的抑制效果与阳性对照地塞米松相当，而地塞米松给药方式为 5 mg/kg 腹腔注射。这提示 A12 具有较好的体内抗炎效果。此外，A12 还可有效恢复系统稳态，表现为预防脓毒症相关低体温，并在 24 h 时阻断晚期炎症介质，如 iNos。在更具临床相关性的盲肠结扎穿孔（CLP）模型中，A12 处理显著延长了脓毒症小鼠的生存时间窗。这些体内数据支持 A12 作为后续机制研究的有力先导候选物。

图1：A12 降低模型小鼠中 TNF-α、IL-6 和 IL-12 的分泌水平。（a）化合物 A12 的设计与发现。（b）A12 在体内降低 LPS 诱导内毒素血症小鼠模型中 TNF-α、IL-6 和 IL-12 水平的作用。A12（10、20、40 mg/kg，口服）和糖皮质激素地塞米松（DEX，5 mg/kg，腹腔注射）于小鼠腹腔注射 LPS（5 mg/kg）前 0.5 h 给药。每组 n = 6–9 只小鼠。所有数据均以均值 ± SEM 表示。与 vehicle 组相比，***P < 0.001，**P < 0.01；与 normal 组相比，## < 0.001。

A12 重塑巨噬细胞炎症相关基因表达

为了阐明 A12 在炎症疾病中发挥作用的潜在机制，研究者对 RAW264.7 细胞进行了 RNA-Seq 分析。在 LPS 刺激的 RAW264.7 细胞中，与未处理细胞相比，有 253 个基因显著上调，987 个基因下调。热图结果显示，不同样本组之间存在明显不同的表达模式，提示组间差异显著。

随后的京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析显示，多个信号通路受到扰动，其中 NF-κB 信号通路富集明显。基因本体生物过程（GOBP）和 KEGG 分析进一步提示，A12 影响的细胞功能主要与炎症反应有关。值得注意的是，Il-6、Il-1β 和 Nos2 等关键促炎基因明显下调，且这一结果通过 qPCR 得到验证。

此外，研究者发现，在炎症条件下，A12 显著抑制巨噬细胞中活性氧（ROS）的产生。A12 的类似抗炎活性也在小鼠原代骨髓来源巨噬细胞（BMDM）和人源巨噬细胞模型 PMA-THP1 中得到确认。

图2：化合物 A12 对巨噬细胞基因表达的影响。（a）与未处理 RAW264.7 细胞相比上调和下调的基因（左图）。火山图展示了定量基因，红点表示上调基因，蓝点表示下调基因。右图显示 LPS 刺激组中显著变化基因的层次聚类结果。（b）A12 处理后显著变化基因的 GOBP 和 KEGG 富集分析。（c）RAW264.7 细胞中促炎基因的 qPCR 验证。（d）RAW264.7 细胞中的活性氧水平。（e）通过 ELISA 检测 BMDM 培养物中 TNF-α、IL-6 和 IL-12 水平。（f）在 PMA-THP1 细胞中，经 LPS 和 A12 处理后，通过 qPCR 检测促炎基因表达。这些结果代表 3 次独立实验。所有数据均以均值 ± SEM 表示。与仅 LPS 处理组相比，***P < 0.001，**P < 0.01；与 blank 组相比，## < 0.001，# < 0.01。

DNAJC9 被鉴定为 A12 的直接作用靶点

A12 对巨噬细胞表现出强效抑制作用，促使研究者进一步寻找其分子靶点。为了避免影响 A12 与靶点之间的特异性结合，同时考虑合成可行性，研究者选择在 D 环引入生物素分子，设计探针分子。基于 A12 结构，研究者设计并合成了 3 个生物素化探针 B1、B2 和 B3。

其中，B1 和 B2 保留了显著抗炎活性，而 B3 基本无活性。因此，B1 和 B2 被作为活性探针，B3 作为阴性探针。随后，研究者开展 pull-down 实验，从 RAW264.7 细胞裂解液中分离 A12 的潜在蛋白靶点。简要而言，探针被固定于链霉亲和素包被的磁珠上，并与细胞裂解液孵育。结合蛋白随后经胰蛋白酶消化，并采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行分析。研究者进一步通过非标记定量方法，比较四个实验组之间的相对蛋白丰度。

与生物素处理对照组 B 相比，阳性探针 B1 和 B2 组分别显著富集 103 个和 113 个蛋白。两个阳性探针组之间共有 77 个重叠蛋白。这些重叠蛋白主要参与 RNA 加工和免疫反应等生物过程。为了开展蛋白丰度统计分析，研究者将对照组中未被定量的蛋白强度统一设为 100。在这些蛋白中，与对照组相比，30 个蛋白在 B1 和 B2 中均显著富集。进一步结合阴性探针 B3 进行联合分析后，仅有 4 个蛋白在 B1 和 B2 中显著富集、但未在 B3 中检测到，因此被视为潜在靶点。

在这 4 个候选蛋白中，Dnajc9 在 B1 和 B2 中均显示最高倍数变化，且两组比较的 P 值均小于 0.05，提示 Dnajc9 可能是 A12 抗炎作用的关键潜在靶点。

随后，pull-down 分析通过考马斯亮蓝染色和免疫印迹验证了 A12 与内源性 Dnajc9 之间的相互作用。为了严格排除非特异性结合，研究者还证实，仅含 linker 和 biotin 结构片段的对照分子既不能富集 DNAJC9，也不能抑制细胞因子释放。

为了验证 A12 与 DNAJC9 之间的直接物理结合，研究者进一步进行了药物亲和反应靶点稳定性（DARTS）实验。该实验基于这样一个生物物理学原理：配体结合可在热力学上稳定靶蛋白结构，从而降低蛋白酶可及性，并增强其对酶解降解的抵抗力。结果显示，与 vehicle 对照相比，A12 处理明显增强了 DNAJC9 的蛋白酶水解耐受性。需要注意的是，这一观察结果反映的是 A12 与 DNAJC9 的直接结合和结构接合，而不是 DNAJC9 表达水平或生物活性的稳定化。

图3：DNAJC9 被鉴定为 A12 的潜在靶点。（a）探针 B1、B2 和 B3 的化学结构。（b）靶点筛选流程概览。（c）维恩图展示不同实验组之间显著富集蛋白靶点的重叠情况。上方图比较 B1 和 B2 相对于生物素对照组 B 的结果；下方图进一步排除了在阴性探针 B3 组中也被检测到的靶点。B3 组中的 964 个蛋白是未被富集的蛋白，即无可用定量数据。（d）B1 和 B2 组重叠潜在靶点的 GO 生物过程富集分析。柱旁数字表示每个生物过程中富集的基因数量。（e）散点图显示同时在 B1 和 B2 组中鉴定到的靶点，红点代表在两个比较组中 P 值均小于 0.05 的靶点，即 B1 vs B 和 B2 vs B。（f）列出 4 个候选靶点，这些靶点在 B1 和 B2 组中富集，但不在 B 组和 B3 组中富集。（g）生物素化 A12 探针 pull-down 实验的 Western blot 分析（左）。DARTS 分析显示，A12 可增强 Dnajc9 的蛋白酶抵抗性（右）。这些结果代表 3 次独立实验。

A12 与 DNAJC9 发生共价相互作用

为了研究靶蛋白 DNAJC9 与 A12 之间的相互作用，研究者首先采用热转移实验检测 A12 是否可直接作用于 DNAJC9。加入 A12 后，DNAJC9 出现负向 Tm 位移，提示 A12 可能降低 DNAJC9 的热稳定性。这些结果说明 A12 能够与 DNAJC9 结合。

与热转移实验结果一致，DNAJC9:A12 混合物的配体观察 CPMG 和饱和转移差谱（STD）核磁共振结果也呈阳性。加入 DNAJC9 后，CPMG 谱显示 A12 的核磁共振信号出现明显线宽化和衰减，提示 A12 能与 DNAJC9 相互作用。同时，在 DNAJC9 存在条件下也检测到 A12 的阳性 STD 信号，进一步支持 A12 与 DNAJC9 之间存在相互作用。

此外，研究者通过 LC-MS 分析比较了 DNAJC9 在有无 A12 处理条件下的质谱差异。结果显示，DNAJC9 的蛋白分子量稳定增加 492 Da，提示 1 个 A12 分子共价结合 1 个 DNAJC9 单体。

为了确定 A12 通过其靶向半胱氨酸的丙烯酰胺共价弹头修饰的具体残基，研究者对 DNAJC9 的 3 个半胱氨酸残基 C7、C150 和 C243 进行了定点突变，构建了单点突变体 C7A、C150A、C243A 以及三突变体 C7A/C150A/C243A。在 C7A 和 C150A 突变体中仍可观察到提示 A12 修饰的分子量位移，但在 C243A 或三突变体中未观察到该位移。该结果表明，A12 特异性共价修饰 DNAJC9 的 C243 残基。进一步的表面等离子体共振（SPR）实验测得 Kd 值为 12.8 μmol/L。上述结果共同说明，A12 可与靶蛋白 DNAJC9 发生共价结合。

此外，研究者还利用 ICE Bioscience 筛选平台，对 A12 进行了 40 种激酶面板测试，以评估其脱靶活性。在 10 μmol/L 浓度下，A12 对多种激酶的抑制作用均较弱，抑制率小于 30%。这些结果支持 A12 具有较好的选择性，并提示其可作为特异性 DNAJC9 抑制剂进一步开发。

图4：化合物 A12 与 DNAJC9 发生共价相互作用。（a）加入 A12 后，DNAJC9 的 Tm 位移值呈剂量依赖性变化。（b）配体观察 CPMG 和 STD 谱数据表明 A12 可直接与 DNAJC9 相互作用。CPMG 谱分别在无 DNAJC9 条件下的 A12（红色）和加入 DNAJC9（5 μmol/L，青色）条件下的 A12 中采集。A12 的 STD 谱在存在 5 μmol/L DNAJC9 的条件下记录。（c）A12 结合后重组 DNAJC9 的质谱分析。混合样品中 DNAJC9:A12 = 1:40。两个主要峰分别代表未修饰的 DNAJC9（M）及其 N 端葡萄糖酰化形式（M + 178 Da）。右侧两个小峰分别对应 M 和 M + 178 Da 与化合物 A12 形成的共价加合物。（d）SPR 实验显示 A12–DNAJC9 相互作用的动力学过程。这些结果代表 3 次独立实验。

干预 DNAJC9 可产生抗炎作用

HSP40/DNAJ 蛋白是 HSP 家族中最大的亚家族，在调控 HSP70 和 HSP90 蛋白活性方面发挥重要作用。其中，DNAJC9 的特点在于其参与整合 ATP 依赖的 HSP70 蛋白功能，并影响 HSP70 介导的炎症反应。已有研究将 DNAJC9 基因与肿瘤发生联系起来，并提示其可能作为乳腺癌生存相关候选生物标志物，但关于其在炎症反应中的作用研究较少。

为了探究 DNAJC9 是否参与炎症调控，研究者在 RAW264.7 细胞或原代巨噬细胞中建立了 siRNA 介导的 DNAJC9 敲低系统。DNAJC9 敲低后，TNF-α、IL-6 和 IL-12 等关键炎症介质释放显著下降，提示 DNAJC9 在炎症过程调控中具有重要作用。关键的是，在 DNAJC9 敲低的 BMDM 中加入 A12，与单独 siRNA 处理组相比，并未进一步显著降低炎症水平。这提示 A12 的抗炎效应在很大程度上依赖于 DNAJC9。

RNA-seq 分析提示，A12 的抗炎作用涉及若干重要通路，其中包括 NF-κB 通路。进一步实验显示，A12 处理或 DNAJC9 敲低均可显著抑制 IκBα 磷酸化，从而提示 NF-κB 通路，尤其是 IκBα 调控，与 DNAJC9 介导的生物学效应之间存在关联。

由于 HSP70 通常被认为是与 DNAJC9 整合发挥作用的关键蛋白，研究者进一步关注 HSP70 相关的细胞内事件。结果显示，A12 处理明显促进 HSP70 在细胞核内聚集。已有研究支持，在热应激和炎症等强烈外源刺激条件下，核内 HSP70 聚集对于维持核仁稳定性具有重要作用。类似地，使用 siRNA 敲低 DNAJC9 后，也观察到 HSP70 在细胞核内聚集增加。

与此同时，研究者在巨噬细胞中过表达 DNAJC9，发现其可促进炎症细胞因子的转录水平升高，而 A12 仍可降低这些基因表达。值得注意的是，生化实验显示，A12 并不直接抑制 HSP70–DNAJC9 复合体的 ATPase 活性，提示其机制可能基于构象性空间位阻，而非酶活性抑制。这说明 A12 的抗炎机制与 HSP 家族存在密切关联。

图5：干预 DNAJC9 可产生抗炎作用。（a）通过 ELISA 检测 RAW264.7 细胞培养物中 TNF-α 和 IL-6 水平。（b）通过 ELISA 检测 BMDM 培养物中 TNF-α、IL-6 和 IL-12 水平。（c）代表性 Western blot 显示，在 BMDM 中存在 A12 或 siRNA 的条件下，不同指定时间点的 IκBα 和 p-IκBα 水平。（d）BMDM 经 LPS 和 A12 处理后，用抗 HSP70 抗体进行染色。（e）Dnajc9 敲低的 BMDM 经 LPS 处理后，用抗 HSP70 抗体进行染色。绿色箭头表示 HSP70 在细胞核内聚集。比例尺，10 μm。（f）U937 细胞转染 pCDNA3.0_DNAJC9 质粒后，经 LPS 和 A12 处理，并通过 qPCR 检测促炎基因表达。这些结果代表 3 次独立实验。所有数据均以均值 ± SEM 表示。***P < 0.001，**P < 0.01，*P < 0.05；ns 表示无显著性；比较方式如图中所示。

【贡献】★★★★★

综上，本研究发现了小分子共价丹参酮衍生物 A12，并将其鉴定为一种抗炎抑制剂。通过引入共价弹头，A12 将丹参酮 IIA 原本较弱的抗炎活性提高约 100 倍，使其达到亚微摩尔活性水平。

鉴于目前脓毒症临床有效治疗手段有限，A12 显示出一定治疗潜力。该化合物可口服给药，并表现出与阳性对照地塞米松相当的疗效。通过合理设计阳性和阴性探针，研究者筛选出 A12 扰动的关键信号通路，并以充分证据锁定 DNAJC9 为其作用靶点。

研究发现，DNAJC9 可通过影响 HSP 复合体及其下游反应，参与炎症发生与调控。研究者进一步推断，A12 通过与 DNAJC9 共价结合发挥抗炎作用。整体而言，本研究验证了 DNAJC9 是一个具有可成药性的靶点，并确立 A12 作为具有潜力的候选药物，为脓毒症及相关炎症性疾病的新治疗策略设计、靶点探索和药物开发提供了综合思路。

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