TRENDS BIOTECHNOL|南京农业大学杨倩教授团队构建枯草芽孢杆菌胞外囊泡 EV 递送平台破解 RNAi 核酸药产业化递送难题

近日，南京农业大学动物医学院林建、杨倩教授团队在中科院一区国际 Top 期刊《Trends in Biotechnology》（IF=16.6）发表题为《Engineered Bacillus subtilis to deliver dsRNA via extracellular vesicles against the H9N2 avian influenza virus》的原创研究论文。该研究以枯草芽孢杆菌胞外囊泡（EV）为核心递送载体，搭建集核酸自产、天然囊泡包载、口服长效给药于一体的益生菌 RNAi 抗病毒平台，从生产、储运、田间应用全链条解决传统兽用核酸药物成本高、易降解、给药繁琐三大痛点，为 H9N2 禽流感等畜禽 RNA 病毒绿色防控提供全新可落地技术方案。

RNA 干扰（RNAi）凭借高特异性、无药物残留优势，是畜禽减抗替抗核心技术路线，但长期存在两大产业化卡脖子瓶颈：一是体外转录合成核酸原料昂贵，脂质、PEI 等人工纳米载体大幅抬升制剂成本；二是裸露双链 RNA 极易被消化道核酸酶降解，仅支持注射给药，规模化养殖实操难度极大。微生物胞外囊泡 EV 是细菌自发分泌的双层磷脂膜纳米囊泡，天然具备核酸包裹、生物相容性好、肠道耐受等优势，是突破递送瓶颈的理想载体，本研究围绕 EV 完成全套体系构建与体内外完整功能验证。研究团队对安全级枯草芽孢杆菌 168 进行基因编辑，引入双向 Pylb 持续表达载体，构建 AAD 工程益生菌。该菌株发酵过程中可自主合成靶向 H9N2 病毒 NS1 免疫逃逸蛋白的 vsiRNA 富集 dsRNA，同步持续分泌胞外囊泡 EV，dsRNA 自动封装于囊泡内部，实现 “活菌核酸工厂和天然纳米递送载体” 一体化，核酸生产成本降低 90% 以上。

图1.工程化枯草芽孢杆菌AAD的囊泡提取验证

胞外囊泡 EV 的磷脂双层膜形成天然防护屏障，可隔绝消化道 RNase 降解，4℃储存 7 天仍保持完整囊泡结构与核酸生物活性，省去人工载体包被工序，同等抗病毒效果下综合用药成本仅为传统体外转录核酸制剂的 1/10。细胞示踪试验证实，Dil 荧光标记的 AAD-EVs 可在 1 小时内被 34% 鸡巨噬细胞摄取，细胞内生成功能性 vsiRNA 总量是商用脂质转染试剂的 48.9 倍；小 RNA 测序证明 EV 递送可产生覆盖全靶序列、18–25 nt 广谱 vsiRNA，沉默覆盖范围与效率远超传统转染体系。

图2.工程化枯草芽孢杆菌AAD囊泡摄取效率和包裹dsRNA验证

攻毒试验证实，采用活菌拌料口服给药后，枯草芽孢杆菌可在家禽肠道稳定定植7天，持续释放载药 EV，经肠道吸收扩散至肺、气管、血液、心肝肾全身靶组织。EV 递送可实现约 70% H9N2 病毒载量下降，显著缓解病毒感染造成家禽减重、肺部病理损伤。机制层面，载药 EV 同步激活宿主 RNAi 沉默通路与干扰素天然免疫通路，实现双重防护。靶点序列提前剔除宿主同源片段，从根源规避脱靶风险。整套 EV 递送平台具备高度模块化特性，仅替换囊泡包裹的病毒特异性 vsiRNA 序列，即可快速适配传染性法氏囊病、猪蓝耳病等各类畜禽 RNA 病毒防控，适配鸡、鸭、生猪全品类规模化养殖场景。该技术规避注射操作，适配养殖场常规拌料饲喂流程，突破实验室研究与田间落地之间的递送壁垒。

图 3 动物试验评估重组菌AAD对禽流感H9N2亚型的保护效果

该论文第一作者为南京农业大学刘佳琛硕士，通讯作者为林建教授。研究过程中，杨倩教授为课题提供了重要指导，课题组的林建教授和崔晓靓老师以及生科院闫新教授、交叉研究院沈宏副教授均给予了宝贵建议。本系列研究先后依托国家自然科学基金、国家重点研发计划、江苏省优青基金、宁夏优青年基金、等多项课题资助，相关核心靶点与益生菌 EV 递送技术已布局多项国家发明专利，形成完整知识产权保护体系。本研究建立的益生菌胞外囊泡 EV 递送 RNAi 体系，打通兽用酸药从实验室走向养殖一线全链条，以微生物天然囊泡替代人工化学载体、发酵自产核酸替代高价体外转录原料、口服群体饲喂替代人工注射，构建低成本、高稳定、广谱安全的畜禽绿色抗病毒新方案，为畜牧行业减抗限抗、保障畜禽产品食品安全提供全新技术支持。