Circulation Research｜心衰线粒体保护新轴：SBK2磷酸化NDUFV1促进其入线粒体，限制病理性心肌肥厚！（折志刚 /李红良团队—武汉大学）

2026年7月6日，武汉大学人民医院折志刚团队、李红良团队等，在Circulation Research（中科院1区，IF=18.0）在线发表题为“SBK2-Driven NDUFV1 Phosphorylation and Translocation Limits Cardiac Hypertrophy”的原创研究论文。

心力衰竭的重要病理基础之一是病理性心肌肥厚，而线粒体功能障碍，尤其是线粒体复合物I活性受损，是推动心肌能量代谢失衡和心功能恶化的关键环节。该研究通过跨物种转录组筛选、UK Biobank遗传关联分析、细胞和小鼠功能实验、蛋白质组学、体外激酶实验、线粒体蛋白导入分析和蓝色原位PAGE等方法，鉴定出心脏富集激酶SBK2是限制病理性心肌肥厚的重要保护因子。

研究发现，SBK2可直接结合并磷酸化线粒体复合物I核心亚基NDUFV1的Ser251位点，增强NDUFV1与胞质分子伴侣HSPA1A的相互作用，并促进其经TOM70依赖方式进入线粒体。进入线粒体后的NDUFV1有助于维持复合物I活性、呼吸超复合体组装、氧化磷酸化、线粒体融合和氧化还原稳态，从而限制压力负荷诱导的心肌肥厚和心功能损害。需要注意的是，本研究证据主要来自小鼠模型和心肌细胞实验，尚不能直接等同于人体临床疗效。

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【摘 要】

背景：心力衰竭仍是全球重大健康负担，其发生发展很大程度上由病理性心肌肥厚驱动。线粒体功能障碍，尤其是线粒体复合物I活性受损，是疾病进展的核心因素之一，但其调控机制尚未完全明确。跨物种转录组筛选和UK Biobank分析发现，SBK2（Src homology 3 domain-binding kinase 2）是一种保守的、心脏富集的激酶，可能与心力衰竭风险相关。研究假设，SBK2可通过调控线粒体复合物I功能影响心肌肥厚。

方法：研究首先基于Gene Expression Omnibus（GEO）数据集识别跨物种保守基因，并在UK Biobank队列中分析SBK2、ADAMTSL2、LOX和SPP1基因上下游±10 kb区域内变异与心力衰竭之间的关联。随后，研究在实验模型和公开的人肥厚型心肌病数据集中检测SBK2表达，并通过心肌细胞和小鼠中的功能获得与功能缺失实验评估其作用。研究还通过蛋白质组学和相互作用组学分析鉴定SBK2底物及互作蛋白，并采用体外激酶实验和共免疫沉淀进行验证。线粒体蛋白导入和呼吸超复合体组装则通过生化分级和蓝色原位PAGE进行评估。

结果：SBK2在肥厚心脏和原代新生大鼠心室肌细胞中表达降低。心肌细胞特异性过表达SBK2可减轻心肌肥厚和纤维化，改善收缩功能，并抑制适应不良性基因表达；相反，敲低SBK2会加重这些表型。机制上，SBK2可直接结合并磷酸化NDUFV1（NADH: ubiquinone oxidoreductase core subunit V1）的Ser251位点。该修饰增强了NDUFV1与胞质分子伴侣HSPA1A（heat shock protein family A [Hsp70] member 1A）之间的相互作用，并促进TOM70（translocase of outer mitochondrial membrane 70）依赖的线粒体导入。线粒体内NDUFV1增加后，可促进复合物I活性、呼吸超复合体组装、氧化磷酸化、线粒体融合和氧化还原稳态。药理性抑制复合物I或沉默NDUFV1均可消除SBK2介导的保护作用。此外，不能被磷酸化的NDUFV1突变体S251A无法挽救SBK2缺失心肌细胞中的肥厚表型。

结论：SBK2是一个上游激酶，可通过磷酸化NDUFV1将胞质信号与线粒体蛋白导入过程连接起来，从而维持复合物I完整性和线粒体功能，限制病理性心肌肥厚。该研究揭示了一条此前未被认识的SBK2-NDUFV1信号轴，将激酶信号、线粒体蛋白稳态和心力衰竭潜在治疗靶点联系起来。

01

研究背景及科学问题

心力衰竭（heart failure，HF）是多种心血管疾病最终共同的病理结局，全球约1%—3%人群受到影响。2021年，全球心力衰竭患者约为5550万人，且患病率仍在上升。心肌肥厚是心力衰竭的重要机制之一。早期心肌肥厚可作为心肌细胞增大的代偿反应，但随后会转变为适应不良状态，推动疾病进展，最终导致失代偿和泵功能障碍。

目前临床药物治疗，如血管紧张素受体-脑啡肽酶抑制剂、β受体阻滞剂、盐皮质激素受体拮抗剂和钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂等，主要用于缓解症状并改善预后，但尚不能逆转病理性重构。因此，寻找能够有效阻止适应不良性心肌肥厚的新分子靶点，仍是当前研究中的重要问题。

病理性心肌肥厚涉及多种机制，包括心肌细胞死亡、Ca²⁺稳态紊乱、线粒体功能障碍、代谢重编程以及胎儿基因重新激活等。其中，线粒体功能障碍尤为关键，因为心肌细胞高度依赖氧化磷酸化产生ATP。能量生成受损已成为心力衰竭的典型特征。

在线粒体中，维持复合物I功能尤其重要。复合物I是氧化磷酸化过程中的关键限速环节。已有研究显示，NDUFV1、NDUFS4和NDUFS6等复合物I亚基的致病性变异，可在人类和实验模型中损害线粒体功能，并促进早发性心肌肥厚和心功能障碍。因此，维持或增强复合物I功能可能是一种具有潜力的治疗思路。

然而，治疗性调控复合物I并不容易。蛋白质翻译后修饰，尤其是磷酸化，已经被认为是重要且具有药物干预潜力的调控机制。蛋白质组学研究已在线粒体复合物I多个亚基中发现多个磷酸化位点，提示复合物I酶活性可能受激酶介导的动态调控。不过，在病理条件下负责这些修饰的具体激酶仍不清楚。鉴于线粒体功能具有组织特异性调控特点，心脏富集激酶可能在这一过程中发挥重要作用。

本研究通过整合无偏转录组分析和UK Biobank数据，发现SBK2表达降低与心力衰竭发生率升高相关，提示其可能参与心肌肥厚和心力衰竭发病。SBK家族是一类丝氨酸/苏氨酸激酶，具有组织特异性调控作用。SBK1广泛表达，并被报道可影响癌症和代谢功能障碍相关脂肪性肝病中的线粒体膜电位和代谢重编程。这些发现提示，心脏富集的同源蛋白SBK2可能在心肌肥厚中具有关键调节功能。

SBK2在心肌细胞中高表达，并可与参与ATP消耗过程的蛋白相互作用，包括翻译、细胞内转运和肌节组织相关蛋白。然而，SBK2是否调控线粒体功能，此前研究仍然不足。

本研究发现，SBK2在人类衰竭心脏和小鼠肥厚心脏中显著降低。功能上，SBK2可通过改善线粒体功能减轻病理性心肌肥厚和心力衰竭。机制上，SBK2可在Ser251位点磷酸化复合物I亚基NDUFV1，增强NDUFV1与HSPA1A之间的相互作用，促进NDUFV1进入线粒体，从而改善线粒体呼吸能力。整体而言，这些发现将SBK2确定为恢复线粒体功能并治疗病理性心肌肥厚的潜在靶点。

02

重要发现及亮点

SBK2是病理性心肌肥厚中保守的应激响应基因，并在肥厚心脏中下调

为了寻找在病理性心肌肥厚发生中具有重要作用的保守调节因子，研究人员首先在多个物种中进行差异表达基因分析。研究从4个GEO小鼠数据集中识别出154个共同差异表达基因；再与大鼠GEO数据集整合，得到18个小鼠-大鼠共享差异表达基因；进一步与猪数据集取交集，得到6个小鼠-大鼠-猪共同差异表达基因；最后与人类Genome Sequence Archive数据集整合，筛选出4个跨物种保守差异表达基因：Sbk2、Adamtsl2、Lox和Spp1。

随后，研究人员分析这些基因与心力衰竭遗传风险的关系。UK Biobank数据中，SBK2、SPP1和ADAMTSL2位点附近可观察到名义显著的单核苷酸多态性信号，而LOX区域未见明显关联。进一步基于GTEx数据进行cis-eQTL分析发现，SBK2附近变异rs310451与人左心室组织中SBK2表达呈名义负相关，而ADAMTSL2和SPP1未显示有意义的表达相关性。整合心力衰竭风险和基因表达后，研究最终锁定SBK2位点内一个重要变异rs310451，其同时与SBK2表达降低和心力衰竭风险升高相关。

在小鼠横主动脉缩窄（transverse aortic constriction，TAC）模型中，SBK2蛋白水平显著下降，而心肌肥厚标志物MYH7、ANP和BNP升高。免疫组织化学也证实TAC心脏中SBK2表达降低。转录水平上，Sbk2 mRNA在TAC心脏中下调，而Myh7、Nppa和Nppb升高。相关性分析显示，SBK2与这些心肌肥厚标志物呈显著负相关。

在苯肾上腺素刺激的新生大鼠心室肌细胞（neonatal rat ventricular myocytes，NRVMs）中，SBK2在mRNA和蛋白水平上均随刺激时间延长而下降，同时上述肥厚标志物在24—48小时内升高。人类肥厚型心肌病数据集分析也显示，与健康对照相比，患者SBK2 mRNA表达显著降低。上述结果共同表明，SBK2是病理性心肌肥厚中一个保守、下调且应激响应的基因。

图1：SBK2（Src homology 3 domain-binding kinase 2）响应病理性心肌肥厚应激。A，病理性心肌肥厚中跨物种差异表达基因（DEGs）鉴定流程。差异表达基因（|log2FC|>2，校正后P<0.05）来自GEO数据库中的小鼠、大鼠和猪转录组数据集，以及GSA数据库中的人类数据集。通过对差异表达基因集进行连续取交集，获得保守基因，包括SBK2、ADAMTSL2（ADAMTS样蛋白2）、LOX（赖氨酰氧化酶）和SPP1（分泌型磷蛋白1）。B，展示SBK2、ADAMTSL2、LOX和SPP1上下游±10 kb范围内单核苷酸多态性（SNPs）的区域关联图。C，SBK2、SPP1和ADAMTSL2上下游±10 kb范围内SNPs与左心室组织中相应基因表达之间的相关性图。D，SBK2、SPP1和ADAMTSL2上下游±10 kb范围内SNPs与心力衰竭（HF）风险及基因表达的整合分析图。E，小鼠Sham或TAC手术12周后心脏中MYH7（肌球蛋白重链7）、ANP（心房钠尿肽）、BNP（B型钠尿肽）和SBK2蛋白表达的代表性Western blot及定量分析（每组n=6只小鼠）。定量分析采用非配对双尾Student t检验。F，小鼠Sham或TAC手术12周后心脏中SBK2表达的代表性免疫组织化学图像及定量分析，IgG作为阴性对照（比例尺=50 µm；每组n=6只小鼠）。组间差异采用非配对双尾Student t检验分析。G，小鼠Sham或TAC手术12周后心脏中Myh7、Nppa、Nppb和Sbk2的mRNA表达水平（每组n=6只小鼠），数据采用非配对双尾Student t检验分析。H，小鼠Sham或TAC手术12周后心脏中Myh7、Nppa、Nppb和Sbk2 mRNA表达的相关性分析（每组n=6只小鼠），统计分析采用Spearman相关检验。I，NRVMs经苯肾上腺素（PE）刺激0、24或48小时后，MYH7、ANP、BNP和SBK2蛋白水平的代表性Western blot及定量分析（n=3次独立实验）。数据采用单因素方差分析，并进行Bonferroni多重比较检验。J，NRVMs经PE刺激0、24和48小时后，Myh7、Nppa、Nppb和Sbk2 mRNA表达水平（n=5次独立实验）。统计分析采用单因素方差分析，其中Myh7和Sbk2采用Tukey事后检验，Nppa和Nppb采用Bonferroni事后检验。K，健康对照和肥厚型心肌病（HCM）患者中SBK2 mRNA相对表达量（PMID: 38780967 IF: 12.8 Q1 B1；健康对照N=8，HCM患者N=12）。数值以均值±SD表示。

SBK2在心肌细胞中显著抑制肥厚反应

研究人员进一步在NRVMs中通过功能获得和功能缺失实验分析SBK2对心肌细胞肥厚的影响。Western blot证实SBK2过表达成功。SBK2过表达显著减轻PE诱导的心肌细胞增大、肥厚相关基因表达升高，以及蛋白水平上的胎儿基因重编程。

相反，SBK2敲低会加重PE诱导的心肌细胞肥厚，表现为细胞面积进一步增大，肥厚标志物在mRNA和蛋白水平上进一步升高。上述结果说明，SBK2可限制病理性心肌细胞肥厚。

图2：SBK2保护新生大鼠心室肌细胞（NRVMs）免受肥厚刺激。A，NRVMs感染GFP（绿色荧光蛋白）对照腺病毒或过表达Sbk2的腺病毒后，FLAG-SBK2（外源性）和内源性SBK2蛋白水平的代表性Western blot及内源性SBK2定量分析（n=3次独立实验）。两组差异采用非配对双尾Student t检验分析。B，NRVMs感染GFP对照腺病毒或过表达Sbk2腺病毒后，经PBS或苯肾上腺素（PE）刺激24小时，α-actinin免疫荧光代表性图像及心肌细胞表面积定量分析。数据采用单因素方差分析，并进行Bonferroni事后检验（比例尺=20 µm；n=5次独立实验）。C，NRVMs感染GFP对照腺病毒或过表达Sbk2腺病毒后，在PBS或PE刺激下，Nppa、Nppb和Myh7 mRNA相对表达水平（n=5次独立实验）。统计分析采用单因素方差分析，并进行Bonferroni事后检验。D和E，NRVMs感染GFP对照腺病毒或过表达Sbk2腺病毒后，经PBS或PE刺激24小时，ANP、BNP、MYH7和SBK2蛋白水平的代表性Western blot及定量分析（n=3次独立实验）。ANP、BNP和MYH7采用单因素方差分析并进行Bonferroni多重比较检验，SBK2采用Tamhane T2检验。F，NRVMs感染对照载体腺病毒或表达shSbk2腺病毒后，SBK2蛋白水平的代表性Western blot（n=3次独立实验）。G，NRVMs感染对照载体腺病毒或表达shSbk2腺病毒后，经PBS或PE刺激24小时，α-actinin免疫荧光代表性图像及心肌细胞表面积定量分析。统计分析采用单因素方差分析并进行Bonferroni事后检验（比例尺=20 µm；n=5次独立实验）。H，NRVMs感染对照载体腺病毒或表达shSbk2腺病毒后，在PBS或PE刺激24小时条件下，Nppa、Nppb和Myh7 mRNA相对表达水平（n=5次独立实验）。Nppa和Myh7采用单因素方差分析并进行Tamhane T2检验，Nppb采用Bonferroni事后检验。I和J，NRVMs感染对照载体腺病毒或表达shSbk2腺病毒后，经PBS或PE刺激24小时，ANP、BNP、MYH7和SBK2蛋白水平的代表性Western blot及定量分析（n=3次独立实验）。ANP、BNP、MYH7和SBK2采用单因素方差分析并进行Bonferroni多重比较检验。数值以均值±SD表示。

心肌细胞特异性过表达SBK2可减轻小鼠压力负荷诱导的心肌肥厚

为明确SBK2在体内心肌肥厚过程中的作用，研究人员使用携带心肌细胞特异性Sbk2的AAV9载体，在小鼠心肌细胞中过表达SBK2。GFP免疫荧光显示，报告基因主要表达于心肌细胞，支持该策略具有心肌细胞靶向转导特征。

在Sham条件下，AAV9-Sbk2显著提高心脏组织SBK2表达；在TAC手术后，AAV9-Sbk2可将被TAC降低的SBK2表达恢复至接近正常Sham基线水平。在无病理刺激条件下，AAV9-Sbk2不影响心重、肺重及其与体重或胫骨长度的比值。但TAC 12周后，与AAV9-vector对照相比，AAV9-Sbk2处理小鼠心重、心重/体重、心重/胫骨长度、肺重/体重和肺重/胫骨长度均显著降低，提示SBK2过表达可改善TAC诱导的心肌肥厚和肺水肿。

超声心动图显示，在无病理刺激时AAV9-Sbk2不影响心脏结构和功能；但在TAC小鼠中，AAV9-Sbk2显著降低左室舒张末内径、收缩末内径、舒张末容积和收缩末容积，提示肥厚性心室重构减轻。相应地，左室射血分数和短轴缩短率升高，说明心脏收缩功能改善。

组织病理学分析显示，AAV9-Sbk2不影响生理状态下心肌细胞横截面积或纤维化，但在TAC后可显著减小WGA染色显示的心肌细胞面积，并减少间质和血管周围纤维化。纤维化标志物Col1a1、Col3a1、Ccn2和Tgfβ1在mRNA和蛋白水平上均下降。SBK2过表达还减轻病理性基因重编程，降低应激标志物Nppa、Nppb和胎儿型Myh7，同时增加成人型Myh6和Tnni3，使Myh7/Myh6和Tnni1/Tnni3比值下降。总体而言，心肌细胞特异性过表达Sbk2可减轻压力负荷诱导的心肌肥厚，改善心室功能，并抑制适应不良性重构和纤维化反应。

图3：SBK2（Src homology 3 domain-binding kinase 2）过表达可减轻横主动脉缩窄（TAC）诱导的小鼠心功能障碍。A，实验设计示意图。注射腺相关病毒（AAV）后3周验证表达，随后进行TAC或Sham手术；术后12周进行超声心动图检测和组织采集。B，AAV-GFP（绿色荧光蛋白）和AAV-Sbk2组在Sham或TAC术后12周的SBK2蛋白表达水平。数据采用单因素方差分析并进行Tamhane T2多重比较检验（每组n=6）。C—H，AAV-GFP和AAV-Sbk2小鼠在Sham或TAC术后12周的心重（HW）、HW/胫骨长度（TL）、HW/体重（BW）、肺重（LW）、LW/TL和LW/BW统计分析（每组n=8）。HW/BW采用单因素方差分析并进行Bonferroni事后检验；HW、HW/TL、LW/TL和LW/BW采用单因素方差分析并进行Tamhane T2检验；LW采用非参数检验并进行Bonferroni校正。I，AAV-GFP和AAV-Sbk2小鼠在Sham或TAC术后12周左心室M型超声心动图代表性图像。水平和垂直比例尺分别代表100 ms和1 mm。J—L，AAV-GFP和AAV-Sbk2小鼠在Sham或TAC术后12周的超声心动图参数定量分析（每组n=8），包括左室收缩末内径（LVIDs）、左室舒张末内径（LVIDd）、左室收缩末容积（LVESV）、左室舒张末容积（LVEDV）、左室射血分数（LVEF）和短轴缩短率（LVFS）。LVIDs和LVEF采用单因素方差分析并进行Bonferroni事后检验；LVIDd、LVESV、LVEDV和LVFS采用单因素方差分析并进行Tamhane T2检验。M，Sham或TAC术后12周心室横切面组织学代表性图像，包括苏木精-伊红（H&E）染色、麦胚凝集素（WGA）染色、血管周围/间质Picro-Sirius Red（PSR）染色。比例尺：H&E为50 µm；WGA为20 µm；PSR为50 µm。N，心室切片中心肌细胞横截面积定量分析（每组n=6），统计分析采用单因素方差分析并进行Bonferroni事后检验。O，心室切片中间质和血管周围纤维化定量分析（每组n=6），统计分析采用单因素方差分析并进行Tamhane T2检验。P，TAC术后12周心室组织中纤维化标志物Col1a1（胶原I型α1链）、Col3a1（胶原III型α1链）、Ccn2（细胞通信网络因子2）和Tgfβ1（转化生长因子β1）mRNA相对表达水平（每组n=6），数据采用非配对双尾Student t检验。Q，TAC术后12周心室组织中纤维化标志物COL1A1、COL3A1、CTGF（结缔组织生长因子）和TGFβ1蛋白表达水平（每组n=6），两组差异采用非配对双尾Student t检验分析。R，TAC术后12周心室组织中心脏重构标志物Nppa、Nppb、Myh7、Myh6（肌球蛋白重链6）、Tnni1（肌钙蛋白I1）和Tnni3（肌钙蛋白I3）mRNA相对表达水平（每组n=6），数据采用非配对双尾Student t检验分析。S，TAC术后12周心室组织中心脏重构标志物ANP、BNP、MYH7、MYH6、TNNI1和TNNI3蛋白表达水平（每组n=6），两组差异采用非配对双尾Student t检验分析。数据以均值±SD表示。对于图3F中非正态分布数据，数值以中位数和四分位距（IQR）表示。

心肌细胞特异性敲除SBK2会加重小鼠心肌肥厚

为进一步确认SBK2在病理性心肌肥厚中的保护作用，研究人员构建心肌细胞特异性Sbk2敲除（Sbk2-CKO）小鼠，并与对照同窝小鼠一起接受TAC手术。Sham条件下，Sbk2-CKO小鼠心脏SBK2表达显著低于对照组，说明基因删除成功。TAC手术本身会降低对照小鼠SBK2表达，而Sbk2-CKO背景进一步加剧这一下降，使SBK2水平显著耗竭。

TAC后，Sbk2-CKO小鼠出现更严重的心肌肥厚，表现为心重、心重/体重、心重/胫骨长度和肺重/体重升高。超声心动图显示，Sbk2-CKO小鼠心室扩张和收缩功能障碍加重，包括舒张末容积、收缩末内径和左室收缩末容积升高，同时左室射血分数和短轴缩短率降低。

组织学结果显示，Sbk2-CKO心脏中TAC诱导的心肌细胞肥大更明显，间质和血管周围纤维化更广泛。与此一致，SBK2缺失强化病理性基因重编程，肥厚标志物Nppa、Nppb、Myh7和Tnni1升高，成人型Myh6和Tnni3下降，Myh7/Myh6和Tnni1/Tnni3比值相应升高。纤维化相关基因Col1a1、Col3a1、Ccn2和Tgfβ1进一步上调，提示纤维化重构加重。上述结果说明，心肌细胞特异性SBK2缺失可加速压力负荷诱导的心肌肥厚、心功能障碍和纤维化重构。

图4：心肌细胞特异性删除SBK2（Src homology 3 domain-binding kinase 2）加重横主动脉缩窄（TAC）诱导的小鼠心功能障碍。A，实验方案示意图：AAV注射后3周验证表达，随后进行TAC手术；术后12周进行超声心动图检测并收集心脏组织。sgRNA在U6启动子驱动下广泛表达，而由于Rosa26-LSL-Cas9小鼠中心肌细胞依赖Cre表达Cas9，基因组编辑被限制在心肌细胞中。B，Control和Sbk2-CKO组在Sham或TAC术后12周的SBK2蛋白表达水平。数据采用单因素方差分析并进行Tamhane T2多重比较检验（每组n=6只小鼠）。C—F，Control和Sbk2-CKO小鼠TAC术后12周的心重（HW）、HW/胫骨长度（TL）、HW/体重（BW）和肺重（LW）/BW统计分析（n=8）。HW和HW/TL采用方差分析并进行Bonferroni校正，HW/BW、LW/BW、LW和LW/TL采用Tamhane T2检验。G，Control和Sbk2-CKO小鼠TAC术后12周左心室运动的M型超声心动图代表性图像。水平和垂直比例尺分别代表100 ms和1 mm。H—J，Control和Sbk2-CKO小鼠TAC术后12周左室收缩末内径（LVIDs）、左室舒张末内径（LVIDd）、左室收缩末容积（LVESV）、左室舒张末容积（LVEDV）、左室射血分数（LVEF）和左室短轴缩短率（LVFS）的定量分析（每组n=8）。LVIDs、LVIDd和LVEDV采用单因素方差分析并进行Bonferroni事后检验，LVESV、LVEF和LVFS采用单因素方差分析并进行Tamhane T2检验。K，Control和Sbk2-CKO小鼠TAC术后12周心室组织横切面代表性图像，包括H&E染色、WGA染色、血管周围PSR染色和间质PSR染色。比例尺：H&E=2 mm，WGA=20 µm，PSR=50 µm。L，Control和Sbk2-CKO小鼠TAC术后12周心肌细胞横截面积定量分析（n=6，方差分析并进行Bonferroni校正）。M，Control和Sbk2-CKO小鼠TAC术后12周间质及血管周围纤维化百分比定量分析（n=6，方差分析并进行Tamhane T2校正）。N，Control和Sbk2-CKO小鼠TAC术后12周左心室中心脏重构标志物Nppa、Nppb、Myh7、Myh6、Tnni1和Tnni3的mRNA表达定量（n=6，双尾t检验）。O，Control和Sbk2-CKO小鼠TAC术后12周左心室中纤维化标志物Col1a1、Col3a1、Ccn2和Tgfβ1的mRNA表达定量（n=6，双尾t检验）。P，TAC术后12周心室组织中心脏重构标志物ANP、BNP、MYH7、MYH6、TNNI1和TNNI3的代表性Western blot及定量分析（每组n=6），两组差异采用非配对双尾Student t检验分析。Q，TAC术后12周心室组织中纤维化标志物COL1A1、COL3A1、CTGF和TGFβ1的代表性Western blot及定量分析（每组n=6），两组差异采用非配对双尾Student t检验分析。数值以均值±SD表示。

质谱鉴定NDUFV1是SBK2的直接下游靶标

鉴于SBK2是一种激酶，研究人员推测其保护作用可能通过结合并磷酸化下游底物实现。因此，研究在Ad-Sbk2感染的NRVMs中进行共免疫沉淀，并开展质谱分析。基于Metascape数据库对所得蛋白进行相互作用通路分析，发现有氧呼吸和呼吸电子传递是最显著富集的通路。

在与这一通路相关的14个潜在分子中，MATR3、NDUFV2、NDUFB10和DLAT由于未能通过共免疫沉淀验证相互作用而被排除。随后，GST pull-down实验确认SBK2与NDUFV1和SLC25A12存在直接相互作用。其他候选蛋白，如CTNNB1、PARP1、NDUFB9、NDUFA10、NDUFA9、SLC25A11、CS和NDUFS3，由于GST pull-down实验未显示直接结合而被排除。

鉴于NDUFV1突变此前已与心功能障碍相关，研究人员将NDUFV1作为后续研究重点。免疫荧光显示，293T细胞中NDUFV1与SBK2存在共定位。NRVMs中的共免疫沉淀进一步证实，FLAG-SBK2过表达后可与内源性NDUFV1结合。为确定互作结构基础，研究构建了一系列缺失线粒体靶向序列、FMN结合结构域、可溶性配体结合结构域或铁硫结合结构域的NDUFV1截短突变体。结果显示，SBK2优先结合NDUFV1的FMN结合结构域。这些结果说明，SBK2可直接与NDUFV1相互作用，NDUFV1可能介导SBK2在心肌肥厚中的保护作用。

图5：NDUFV1（NADH: ubiquinone oxidoreductase core subunit V1）被鉴定为SBK2（Src homology 3 domain-binding kinase 2）的潜在直接下游靶标。A，免疫沉淀-质谱（IP-MS）流程。新生大鼠心室肌细胞（NRVMs）感染Ad-Sbk2 12小时，随后接受苯肾上腺素（PE）刺激24小时。进行IgG或Flag免疫沉淀，并通过银染和后续质谱分析样本。B，鉴定蛋白的通路富集分析点图。质谱（MS）数据筛选标准定义为特异性肽段≥3，并且Flag组相较IgG对照组多出≥3个肽段。富集分析采用Metascape数据库。在点图中，点的大小代表每条通路中富集基因的数量，x轴表示统计显著性，即−log（P值）。C，Flag-SBK2与HA-CTNNB1（β-catenin）、MATR3（matrin 3）、PARP1（poly[ADP-ribose] polymerase 1）、NDUFV2、NDUFB10、NDUFB9、NDUFA10、DLAT、NDUFA9、SLC25A11、SLC25A12、CS、NDUFS3和NDUFV1共免疫沉淀（Co-IP）的代表性结果（n=3次独立实验）。D—M，GST-HA或GST-HA-SBK2与Flag-NDUFV1、SLC25A12、NDUFA9、NDUFA10、NDUFB9、NDUFS3、SLC25A11、CS、CTNNB1和PARP1进行GST pull-down实验的代表性结果（n=3次独立实验）。N，293T细胞中Flag-SBK2和HA-NDUFV1共定位的代表性共聚焦图像（n=3次独立实验），比例尺=10 µm。O，NRVMs感染Ad-Sbk2 12小时并经PE刺激24小时后，NDUFV1与FLAG-SBK2相互作用的代表性Co-IP结果（n=3次独立实验）。P，293T细胞共转染Flag-SBK2和不同HA-NDUFV1截短突变体后进行Co-IP实验的代表性结果（n=3次独立实验）。GST表示谷胱甘肽S-转移酶。

SBK2通过Ser251位点磷酸化促进NDUFV1进入线粒体

研究进一步探索SBK2结合如何影响NDUFV1功能。TAC体内模型或NRVMs中PE刺激均不改变NDUFV1总蛋白水平，但PE刺激会减少NDUFV1在线粒体中的定位。SBK2过表达促进NDUFV1在线粒体中积累，而SBK2敲低则减少NDUFV1线粒体积累。

Phos-tag分析显示，PE刺激后NDUFV1磷酸化水平降低。相应地，在肥厚应激条件下，SBK2过表达增加NDUFV1磷酸化，而SBK2敲低降低NDUFV1磷酸化。体内结果与体外一致：TAC显著降低野生型小鼠心肌组织中NDUFV1磷酸化；AAV介导的SBK2过表达可在TAC后维持NDUFV1磷酸化；心肌细胞特异性SBK2敲除则进一步加重TAC诱导的NDUFV1磷酸化下降。体外激酶实验表明，SBK2可直接磷酸化NDUFV1。

为判断激酶活性是否必要，研究人员构建了激酶失活SBK2突变体D185N。该突变体不能在293T细胞和NRVMs中增强NDUFV1磷酸化，也不能缓解PE诱导的肥厚和肥厚基因表达，说明SBK2的心脏保护功能依赖其激酶活性。

亚细胞分级显示，SBK2几乎不定位于线粒体，而主要分布于胞质，提示SBK2主要在胞质中发挥功能。跨物种序列分析在NDUFV1中发现4个保守丝氨酸位点：S21、S31、S34和S251。分别将这些位点突变为丙氨酸后发现，仅S251A突变可消除SBK2诱导的磷酸化，而不影响SBK2-NDUFV1结合。体外实验同样显示，SBK2不能磷酸化S251A突变体，说明Ser251是主要磷酸化位点。

进一步实验显示，Ser251磷酸化控制NDUFV1线粒体靶向。SBK2可促进野生型NDUFV1进入线粒体，但不能促进S251A突变体进入线粒体；相反，磷酸化模拟突变体S251D表现出持续的线粒体定位。上述结果说明，Ser251磷酸化调控NDUFV1线粒体转位。

为了阐明这一导入过程的机制，研究人员检测NDUFV1与线粒体导入相关组分的相互作用。NDUFV1可与多个胞质分子伴侣和TOM受体相关联。值得注意的是，SBK2选择性增强NDUFV1与HSPA1A之间的相互作用，但不改变其与HSPA1B、TOM20或TOM70的结合。HSPA1A过表达可增加NDUFV1向TOM70而非TOM20的募集，支持HSPA1A在其中具有“分子伴侣桥接”作用。重要的是，S251A突变会消除SBK2增强的NDUFV1-HSPA1A相互作用，并阻止HSPA1A依赖的TOM70募集。HSPA1A siRNA敲低也可阻断SBK2驱动的NDUFV1线粒体积累。

总体而言，这些数据支持一个连续机制：SBK2在Ser251位点磷酸化NDUFV1，增强其被HSPA1A识别，并促使其通过TOM70依赖方式进入线粒体。

图6：SBK2（Src homology 3 domain-binding kinase 2）促进NDUFV1（NADH: ubiquinone oxidoreductase core subunit V1）磷酸化及其在线粒体中的积累。A，小鼠Sham或横主动脉缩窄（TAC）手术12周后心脏中NDUFV1蛋白水平的代表性Western blot及定量分析（每组n=6）。两组差异采用非配对双尾Student t检验分析。B，新生大鼠心室肌细胞（NRVMs）经苯肾上腺素（PE）刺激24小时后NDUFV1蛋白水平的代表性Western blot及定量分析（n=3次独立实验）。两组差异采用非配对双尾Student t检验分析。C，NRVMs经PE或Vehicle刺激24小时后，全细胞裂解物（WCL）、胞质（Cytosol）和线粒体（Mito）组分中NDUFV1蛋白水平的代表性Western blot及定量分析（n=3次独立实验）。两组差异采用非配对双尾Student t检验分析。D，NRVMs感染Ad-GFP或Ad-Sbk2并经PE刺激24小时后，WCL、胞质和线粒体组分中NDUFV1蛋白水平的代表性Western blot及定量分析（n=3次独立实验）。两组差异采用非配对双尾Student t检验分析。E，NRVMs感染Ad-vector或Ad-shSbk2并经PE刺激24小时后，WCL、胞质和线粒体组分中NDUFV1蛋白水平的代表性Western blot及定量分析（n=3次独立实验）。两组差异采用非配对双尾Student t检验分析。F，野生型小鼠Sham和TAC组心肌组织中磷酸化NDUFV1（Phos-NDUFV1）的代表性Phos-tag Western blot及定量分析（每组n=6）。Phos表示在预期分子量位置检测到的磷酸化NDUFV1。两组差异采用非配对双尾Student t检验分析。G，AAV-GFP或AAV-Sbk2注射小鼠TAC 12周后心肌组织中NDUFV1磷酸化水平的代表性Western blot及定量分析（每组n=6）。两组差异采用非配对双尾Student t检验分析。H，Control和Sbk2-CKO小鼠TAC 12周后心肌组织中NDUFV1磷酸化水平的代表性Western blot及定量分析（每组n=6）。两组差异采用非配对双尾Student t检验分析。I，使用纯化GST-HA或GST-HA-SBK2与纯化FLAG-NDUFV1孵育进行体外激酶实验（n=3次独立实验）。J，在候选磷酸化位点S21A、S31A、S34A和S251A进行定点突变后，HA-NDUFV1磷酸化水平的代表性Western blot及Co-IP实验（n=3次独立实验）。K，使用纯化GST-HA或GST-HA-SBK2与纯化Flag-NDUFV1或Flag-NDUFV1S251A进行体外激酶实验（n=3次独立实验）。L，293T细胞中S251位点定点突变（S251A或S251D）后，HA-NDUFV1在WCL、胞质和线粒体中的分布及定量分析（n=3次独立实验）。M，Flag-SBK2对HA-NDUFV1与V5-HSPA1A相互作用影响的代表性Co-IP结果（n=3次独立实验）。N，HSPA1A对NDUFV1与TOM70相互作用影响的代表性Co-IP结果（n=3次独立实验）。O，S251A突变对SBK2增强的NDUFV1-HSPA1A相互作用及HSPA1A依赖性TOM70募集影响的代表性Co-IP结果（n=3次独立实验）。P和Q，在NRVMs先感染Ad-GFP或Ad-Sbk2后，再转染si-NC或si-Hspa1a 24小时，WCL、胞质和线粒体组分中NDUFV1蛋白水平的代表性Western blot及定量分析（n=3次独立实验）。WCL数据采用单因素方差分析但未进行事后检验；胞质和线粒体数据采用单因素方差分析并进行Bonferroni事后检验。数值以均值±SD表示。GST表示谷胱甘肽S-转移酶；HSPA1A表示heat shock protein family A (Hsp70) member 1A。

SBK2增强线粒体复合物I活性并维持线粒体完整性

研究随后分析SBK2是否调控线粒体呼吸功能。心脏中过表达SBK2可提高复合物I、II和IV活性，而心肌细胞特异性删除SBK2则降低这些复合物活性。相比之下，复合物III和V未发生明显变化。

在PE刺激心肌细胞的应激条件下，Seahorse检测显示，SBK2过表达显著增强基础呼吸、ATP相关呼吸、最大呼吸和备用呼吸能力；相反，SBK2敲低显著抑制这些呼吸参数。这说明SBK2可在肥厚应激下提高氧化磷酸化效率。

与此一致，SBK2过表达提高复合物I代表性亚基NDUFB8、复合物II亚基SDHB和复合物IV亚基MTCO2水平，而SBK2敲低降低这些亚基水平；复合物III亚基UQCRC1和复合物V亚基ATP5A1基本不受影响。蓝色原位PAGE进一步显示，SBK2过表达促进呼吸超复合体CI+III2和CI+III2+IVn组装，结果与酶活性变化一致。

透射电镜结果显示，TAC后SBK2过表达可维持线粒体超微结构，表现为线粒体体积增加、圆形度降低，而不影响基线形态；相反，SBK2缺失降低线粒体体积并增加线粒体碎片化。SBK2过表达还调控线粒体动力学相关蛋白，促进融合相关蛋白表达并抑制过度裂变趋势。功能上，SBK2过表达有助于维持线粒体膜电位，并减少PE诱导的线粒体活性氧升高。综合来看，SBK2可通过增强复合物I功能、促进呼吸超复合体组装、支持线粒体融合并降低氧化应激，维持线粒体完整性。

图7：SBK2（Src homology 3 domain-binding kinase 2）改善线粒体复合物I活性，减轻线粒体碎片化，并维持线粒体功能。A，AAV-GFP（绿色荧光蛋白）、AAV-Sbk2、Control和Sbk2-CKO小鼠TAC术后12周心脏组织中线粒体复合物I—V的酶活性（每组n=6只小鼠）。统计显著性采用双尾Student t检验确定。B和C，NRVMs感染Ad-GFP或Ad-Sbk2，或感染Ad-vector或Ad-shSbk2，并经苯肾上腺素（PE）刺激24小时后，采用Seahorse线粒体压力测试分析基础呼吸、ATP相关呼吸、最大呼吸和备用呼吸能力（n=5次独立实验）。两组差异采用双尾Student t检验分析。D和E，NRVMs感染Ad-GFP或Ad-Sbk2（D），或感染Ad-vector或Ad-shSbk2（E），并经PE刺激24小时后，氧化磷酸化（OXPHOS）复合物I（NDUFB8）、II（SDHB）、III（UQCRC1）、IV（MTCO2）和V（ATP5A1）蛋白的代表性Western blot及定量分析（n=3次独立实验）。统计比较采用双尾Student t检验。F和G，NRVMs感染Ad-GFP或Ad-Sbk2（F），或感染Ad-vector或Ad-shSbk2（G），并经PE刺激24小时后，采用蓝色原位PAGE（BN-PAGE）分析线粒体复合物I（NDUFB8）水平（n=3次独立实验）。统计比较采用双尾Student t检验。H—K，AAV9-GFP、AAV9-Sbk2、Control和Sbk2-CKO小鼠TAC术后12周心脏组织透射电镜（TEM）代表性图像，并对线粒体面积和圆形度进行定量分析（每组n=6只小鼠）。比例尺：2 µm（5000×）和1 µm（12000×）。过表达组线粒体面积采用单因素方差分析并进行Tamhane T2事后检验；圆形度指数采用单因素方差分析并进行Bonferroni事后检验。Sbk2-CKO比较中，线粒体面积和圆形度均采用单因素方差分析并进行Tamhane T2事后检验。L，NRVMs感染Ad-GFP或Ad-Sbk2并经PE刺激24小时后，线粒体动力学相关蛋白OPA1（mitochondrial dynamin like GTPase）、MFN2（mitofusin 2）、FIS1（mitochondrial fission 1 protein）和DRP1（dynamin-1-like protein）的代表性Western blot及定量分析（n=3次独立实验）。两组差异采用双尾Student t检验分析。M，NRVMs感染Ad-GFP或Ad-Sbk2后，经PBS或PE刺激24小时，四甲基罗丹明乙酯（TMRE）荧光强度的代表性直方图及定量分析（n=5次独立实验）。平均TMRE荧光强度反映线粒体膜电位（ΔΨm）。数据采用单因素方差分析并进行Bonferroni事后检验。N，NRVMs感染Ad-GFP或Ad-Sbk2后，经PBS或PE刺激24小时，MitoSOX染色代表性图像及线粒体活性氧（ROS）水平定量分析（n=5次独立实验）。统计分析采用单因素方差分析并进行Bonferroni事后检验（比例尺=10 µm）。数值以均值±SD表示。

SBK2的保护作用依赖NDUFV1及其Ser251磷酸化

为了判断SBK2抗心肌肥厚作用是否依赖复合物I，研究人员在PE刺激下使用复合物I抑制剂鱼藤酮处理NRVMs。复合物I抑制可消除SBK2过表达的保护作用，Ad-Sbk2+鱼藤酮组心肌细胞增大和肥厚标志物表达与鱼藤酮处理的对照组相当。这说明完整的复合物I活性是SBK2发挥保护作用所必需的。

随后，研究人员检测NDUFV1是否是SBK2功能所必需。siRNA介导的NDUFV1敲低消除了SBK2过表达的保护作用，使心肌细胞面积增大、肥厚基因表达升高，支持SBK2作用依赖NDUFV1。

为评估Ser251磷酸化的重要性，研究构建表达磷酸化缺陷型NDUFV1-S251A和磷酸化模拟型NDUFV1-S251D的腺病毒。在SBK2敲低心肌细胞中，S251A突变体不能挽救肥厚表型；而S251D突变体显著抑制肥厚反应，并比野生型NDUFV1产生更强保护作用。与此一致，S251A突变体线粒体定位受损，而S251D突变体线粒体定位增强。

功能上，野生型NDUFV1可部分恢复SBK2缺失心肌细胞中的复合物I活性，而NDUFV1-S251A无法恢复这一活性；相反，磷酸化模拟型NDUFV1-S251D使复合物I活性进一步高于野生型水平。BN-PAGE分析也显示，Ser251磷酸化影响呼吸超复合体组装：S251A减少超复合体形成，而S251D促进超复合体组装。

综合这些结果，研究支持这样一个模型：SBK2通过在Ser251位点磷酸化NDUFV1，促进其线粒体导入，增强复合物I功能并促进呼吸超复合体组装，从而抑制病理性心肌肥厚。

图8：SBK2（Src homology 3 domain-binding kinase 2）的功能作用依赖NDUFV1（NADH: ubiquinone oxidoreductase core subunit V1）及其磷酸化。A，NRVMs感染Ad-GFP（绿色荧光蛋白）或Ad-Sbk2，预先用DMSO或鱼藤酮处理，并经苯肾上腺素（PE）刺激24小时后，α-actinin免疫荧光代表性图像及心肌细胞横截面积定量分析（n=5次独立实验）。统计分析采用单因素方差分析并进行Bonferroni事后检验（比例尺=20 µm）。B，NRVMs按照A所述处理后，Nppa、Nppb和Myh7 mRNA相对表达水平（n=5次独立实验）。统计分析采用单因素方差分析并进行Bonferroni事后检验。C，NRVMs按照A所述处理后，ANP、BNP和MYH7蛋白水平的代表性Western blot及定量分析（n=3次独立实验）。统计分析采用单因素方差分析并进行Bonferroni多重比较检验。D，NRVMs转染si-NC或si-Ndufv1 24小时后，NDUFV1蛋白水平的代表性Western blot及定量分析（n=3次独立实验）。两组差异采用非配对双尾Student t检验分析。E，NRVMs感染Ad-GFP或Ad-Sbk2、转染si-NC或si-Ndufv1，并经PE刺激24小时后，α-actinin免疫荧光代表性图像及心肌细胞横截面积定量分析（n=5次独立实验）。统计分析采用单因素方差分析并进行Tamhane T2检验（比例尺=20 µm）。F，NRVMs按照E所述处理后，Nppa、Nppb和Myh7 mRNA相对表达水平（n=5次独立实验）。Nppa和Nppb采用单因素方差分析并进行Tamhane T2检验，Myh7采用Bonferroni事后检验。G，NRVMs按照E所述处理后，ANP、BNP和MYH7蛋白水平的代表性Western blot及定量分析（n=3次独立实验）。统计分析采用单因素方差分析并进行Bonferroni多重比较检验。H，NRVMs过表达Ndufv1、Ndufv1S251A或Ndufv1S251D 24小时后，Flag-NDUFV1磷酸化水平的代表性Phos-tag Western blot及定量分析（n=3次独立实验）。Phos表示在预期分子量位置检测到的磷酸化NDUFV1。统计分析采用单因素方差分析并进行Bonferroni事后检验。I，NRVMs感染Ad-shSbk2，并随后感染Ad-GFP、Ad-Ndufv1、Ad-Ndufv1S251A或Ad-Ndufv1S251D，再经PE刺激24小时后，actinin免疫荧光代表性图像及心肌细胞横截面积定量（n=5次独立实验）。统计分析采用单因素方差分析并进行Bonferroni事后检验。比例尺=20 µm。J，NRVMs按照I所述处理后，Nppa、Nppb和Myh7 mRNA相对表达水平（n=5次独立实验）。统计分析采用单因素方差分析并进行Tamhane T2检验。K，NRVMs按照I所述处理后，ANP、BNP和MYH7蛋白水平的代表性Western blot及定量分析（n=3次独立实验）。L，NRVMs按照I所述处理后，胞质和线粒体组分中NDUFV1蛋白水平的代表性Western blot及定量分析（n=3次独立实验）。胞质组分采用单因素方差分析并进行Bonferroni事后检验，线粒体组分采用单因素方差分析并进行Tamhane T2事后检验。M，NRVMs按照I所述处理后，线粒体复合物I酶活性定量分析（n=5次独立实验）。统计分析采用单因素方差分析并进行Bonferroni事后检验。数值以均值±SD表示。

【贡献】★★★★★

本研究明确了SBK2是线粒体复合物I功能的重要调节因子，并将“激酶控制的线粒体蛋白稳态”定位为心脏重构中的关键调节轴。SBK2可在Ser251位点磷酸化NDUFV1，促进其被HSPA1A识别，并通过TOM70依赖机制进入线粒体。NDUFV1进入线粒体后，有助于维持复合物I完整性、呼吸超复合体组装和线粒体生物能量功能，从而限制病理性心肌肥厚和心功能恶化。

研究还提示，压力负荷等心脏应激条件下SBK2表达降低，会削弱这一保护性信号轴，造成NDUFV1线粒体导入不足、复合物I功能下降、氧化磷酸化受损、线粒体碎片化和氧化应激升高，最终加重心肌肥厚和心力衰竭相关表型。

从转化角度看，维持SBK2活性，或模拟其对NDUFV1 Ser251位点的磷酸化效应，可能成为改善心力衰竭中线粒体功能障碍的新方向。不过，研究也存在局限：实验主要使用雄性小鼠，尚需评估性别差异；AAV过表达策略主要属于预防性干预，尚未证明其对已建立疾病的治疗效果；SBK2敲低后仍存在一定残余NDUFV1磷酸化，提示可能还有其他激酶参与调控；此外，内源性NDUFV1 Ser251磷酸化的体内直接验证以及HSPA1A/TOM70依赖导入模型的动态过程，仍有待进一步研究。总体而言，该研究揭示了一条新的“胞质激酶信号-线粒体蛋白导入-复合物I稳态”通路，为未来缓解心力衰竭中的线粒体功能障碍提供了新的机制基础和潜在干预方向。

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