Adv Sci | 顾臻/肖庆全/魏迎辉/李国玲团队合作开发紧凑型Cas9d碱基编辑器

DNA 碱基编辑器（BEs）因无需 DNA 双链断裂及供体模板即可实现精准碱基转换，已成为基因编辑领域的重要工具。然而，传统 Cas9 核酸酶体型较大，制约了体内基因治疗最常用载体——腺相关病毒（ AAV ，容量约 4.7 kb ）的单载体递送。而现有的微型 基因编辑 系统（如 IscB ）虽尺寸小，但因间隔序列过短面临脱靶率高 ，且 靶向范围受限等瓶颈。

近日， 浙江大学顾臻教授、肖庆全研究员联合西北农林科技大学魏迎辉教授、中科中山药物创新研究院李国玲副研究员 等团队，在 Advanced Science 杂志发表了题为 Compact 9dBEs Enable Efficient and Precise Genome Editing in Mammalian Cells and In Vivo 的研究论文。该研究通过结构指导的理性设计，对gRNA支架和核酸酶蛋白改造，将紧凑型Cas9d开发为高效、高特异性的Cas9dUltra系统，并进一步构建了衍生碱基编辑器。该工具实现了单AAV递送的体内Pcsk9基因编辑与降脂作用，为体内单载体基因治疗提供了全新的多功能工具箱。

研究团队聚焦于 来自 Deltaproteobacteria 的 II-D 型 Cas9 同源蛋白—— Cas9d （ MG34-1 ）。该蛋白仅 747 个氨基酸，天然具备与经典 Sp Cas9 相同的 20-nt 标准间隔序列和 NGG PAM 识别机制，是微型 OMEGA 系统与大型 Cas9 系统之间的进化桥梁。针对野生型 Cas9d 在哺乳动物细胞中编辑活性极低的问题，研究团队借助 AlphaFold3 预测了 Cas9d-gRNA-dsDNA 三元复合物的三维结构，并开展了理性 改造 。

对于 gRNA ，团队通过截短茎环结构、消除错配并替换稳定碱基对，在将 gRNA 缩短 25 个核苷酸的同时大幅提升了编辑效率。在蛋白质工程方面，团队通过精氨酸扫描（ Arg-screening ）引入带正电荷的精氨酸突变，增强了效应蛋白与 gRNA 及靶 DNA 的相互作用。经历多轮组合优化， 团队开发出 Cas9d Ultra 。实验表明， Cas9d Ultra 在哺乳动物细胞中的切割效率达到 6 0 % 以上 ，较野生型系统提升了 3.1 倍。全基因组无偏脱靶检测（ GUIDE-seq ）进一步证实该系统具有极高的特异性。

在 Cas9d Ultra 的基础上，研究团队将其切口酶分别与不同的碱基修饰酶融合，构 建了腺嘌呤碱基编辑器（ 9dABE ）与胞嘧啶碱基编辑器（ 9dCBE ）。为验证 Cas9d Ultra 在胚胎水平的编辑能力，团队向小鼠受精卵中 分别 注射 Cas9d Ultra 和 9dCBE 系统，高效敲除 Tyr 基因并培育出白化小鼠模型。

随后，研究团队针对胆固醇代谢关键靶点 Pcsk9 基因评估了 BE 系统 的体内基因治疗潜力。通过单 AAV 载体 递送系统，团队对新生小鼠进行了腹腔注射。 5 周 时 的检测结果显示， 9dABE 在小鼠肝脏中的编辑效率为 3.5% - 11.9% ，而 9dCBE 的平均编辑效率达到 15.7% （最高达 28.9% ）。治疗组小鼠血清中的低密度脂蛋白胆固醇（ LDL-C ）水平显著降低，证实了该紧凑型碱基编辑器在体内单载体递送治疗中的有效性。

总之，该研究通过对gRNA支架和蛋白的改进，克服了传统大型CRISPR系统超出单AAV载体包载容量的限制，开发出高效、特异的微型基因编辑工具箱。这一成果为生物医学研究提供了新型底层工具，并为以高血脂症为代表的遗传性疾病提供了体内单病毒载体基因治疗的新方案。

浙江大学顾臻教授、肖庆全研究员、西北农林科技大学魏迎辉教授和中科中山药物创新研究院李国玲副研究员为论文的 共同通讯作者 。 浙江大学 肖庆全研究员、田之锦博士后、博士研究生翁璐琦、西北农林科技大学徐坤副教授、中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）韩鼎毅博士为该论文 共同第一作者 。

原文链接：http://doi.org/10.1002/advs.77279

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