上海
CRISPR-Cas9 已成为基因编辑领域的重要工具，但其靶向范围受限于对 PAM （ protospacer adjacent motif ）序列的识别特异性。为突破这一限制，研究人员已通过蛋白质工程、定向进化和结构指导设计等策略开发出多种 PAM 兼容性扩展的 Cas9 变体，但在扩大靶向范围的同时保持高效率仍是当前面临的主要挑战之一。
近日 ，吉林大学李占军教授团队在 Genome Biology 发表题为 Reconstruction of PAM-interacting domains to broad PAM compatibility 的研究论文。该研究提出一种基于祖先序列重建（ ancestral sequence reconstruction, ASR ）的Cas9PAM工程化策略，REPAM （ Reconstruction of PAM-Interacting Domains ） 。该策略将天然Cas9中的PAM互作结构域替换为祖先来源的PID，从而在不影响核心催化功能的前提下，拓展PAM识别兼容性。
研究团队首先以 NmeCas9 同源蛋白家族为模型，通过多序列比对和祖先序列重建获得共同祖先 PID ，并分别将其 替换至 Nme1Cas9 和 Nme2Cas9 中，构建获得变体 Nme1-REP 和 Nme2-REP 。实验结果表明，二者 PAM 识别谱由 N₄GATT 和 N₄CC 扩展为 N₄CNH （ H = A/C/T ），理论基因组靶向覆盖范围由 0.39% （ Nme1Cas9 ）和 6.25% （ Nme2Cas9 ）提升至 18.57% 。进一步在 Nme2-REP 基础上引入定点突变，获得的 Nme2-REPro 可识别 N₄VHH （ V = A/G/C ） PAM ，理论覆盖范围扩展至 42.19% 。
进一步 将该策略应用于 SpaCas9 ，重建其祖先 PID 并构建变体 Spa-REP 。 Spa-REP 识别更为宽松的 NNHH PAM ，理论基因组覆盖范围由 1.56% 提高至 56.25% ，提升约 36 倍。在人类 HEK293T 细胞中， Spa-REP 表现出良好的编辑活性，最高编辑效率达 76.6% ，在多数测试位点上总体编辑效率优于当前广泛应用的低 PAM 依赖性变体 SpRY 。此外，团队进一步构建了 Spa-REP-ABE 和 Spa-REP-CBE 碱基编辑系统，在 SpaCas9 偏好 的 PAM 位点及非 偏好 PAM 位点均能实现高效碱基 编辑 。在应用层面，团队评估了 Spa-REP 碱基编辑器在引入 BCL11A 调控区域突变、 SLC30A8 R138X 保护性遗传变异及 RELA 剪接受体位点突变以实现外显子跳跃等方面的潜力，结果显示其在疾病相关位点的精准模拟中具有可行性。
综上，该研究提出的 REPAM 策略整合了蛋白质进化信息和结构域模块化替换的设计思路，验证了祖先 PAM 互作结构域作为 Cas9 功能优化模块的可行性，为开发广谱 PAM 兼容 性 的 CRISPR 编辑工具提供了一种新的工程化路径。
吉林大学博士研究生牛文超，博士后钱育强和博士研究生王迪为论文的共同第一作者； 李占军教授、 赖良学教授为论文的共同通讯作者。
原文链接： https://link.springer.com/article/10.1186/s13059-026-04241-5
制版人：十一
学术合作组织
（*排名不分先后）
推荐直播
转载须知
【非原创文章】本文著作权归文章作者所有，欢迎个人转发分享，未经作者的允许禁止转载，作者拥有所有法定权利，违者必究。
BioArt
Med
Plants
人才招聘
特别声明：以上内容(如有图片或视频亦包括在内)为自媒体平台“网易号”用户上传并发布，本平台仅提供信息存储服务。
Notice: The content above (including the pictures and videos if any) is uploaded and posted by a user of NetEase Hao, which is a social media platform and only provides information storage services.
