小鼠嗅觉习惯化-去习惯化实验方案

嗅觉是啮齿类动物最核心的感知模态，直接调控摄食、社交、领地识别、天敌规避等关键行为。嗅黏膜感知信号经主嗅球（MOB）完成初级编码与整合，嗅球神经发生异常、环路重构及神经元传递效率改变，会直接导致嗅觉敏感度、气味辨别与嗅觉记忆功能损伤。

嗅觉习惯化-去习惯化实验是目前评价小鼠嗅觉感知阈值、气味分辨能力、嗅觉学习记忆的经典无创范式，可精准反映嗅球神经源性功能改变，适用于神经发育、神经退行性疾病、精神模型及药理干预评价。

本方案依托标准化嗅觉箱体与VisuTrack动物行为视频分析系统，实现嗅觉行为全自动量化分析，规避人工统计误差。

一、实验动物与饲养标准

选用健康雄性C57BL/6J或CD1小鼠，同批次动物年龄差≤14 d（嗅球神经发生速率高度依赖年龄）。

饲养环境恒温23±2 ℃、恒湿，12 h/12 h明暗循环，自由摄食饮水。统一采用雄性小鼠可排除动情周期激素波动对嗅觉感知的干扰。

实验分组每组10–12只，有效降低个体行为离散度。所有动物操作遵循动物伦理与ARRIVE实验规范。

二、实验试剂与耗材

采用无情绪偏向的人工合成气味剂，避免先天偏好/厌恶干扰实验结果：

柠檬样香叶腈、玫瑰样香叶醇，以矿物油（Sigma M5904）梯度稀释，稀释梯度1:160～1:10。

矿物油作为空白对照溶剂，所有气味原液与稀释液避光密封保存，减少挥发损耗。

配套耗材包含无菌棉签、微量移液器及枪头、1.5 mL离心管、密封收纳袋等，单次刺激更换全新棉签，杜绝气味残留交叉干扰。

三、标准化实验硬件（适配VisuTrack）

整套设备为欣软定制化嗅觉行为检测箱体，外尺寸22.5 cm×22.5 cm×29.5 cm，亚克力密闭避光结构。箱体侧壁预留直径1 cm标准化换味孔，开孔距底面8 cm、侧棱11.2 cm，可平稳固定棉签、精准控制气味伸入长度（探出内壁3 cm）。

搭配Visutrack【型号XR-VT】动物行为分系软件直接使用

箱体配置透明密封顶盖，抑制气味外溢，保障箱内气味浓度稳定。测试房间保持正压通风，换气频次≥20次/小时，快速清除残留气味，环境采用柔和间接暗光，规避强光应激。

顶部高清摄像头垂直采集，镜头距顶盖30–40 cm，对接VisuTrack软件完成轨迹与嗅探行为识别。每轮实验前后采用10%酒精彻底擦拭箱体，更换全新垫料，完全消除环境线索干扰。

四、实验流程设计1. 环境适应与空白习惯化

小鼠提前转移至测试室适应环境，轻柔放入测试箱，自由探索3 min完成环境适配。通过侧壁小孔引入空白矿物油棉签，单次刺激时长1 min，间隔1 min，重复5次，使小鼠适应棉签刺激与操作范式，消除新物体探索偏差。全程VisuTrack实时录像，划定气味源周边感兴趣区域（ROI），自动记录嗅探时长、趋近频次与探索轨迹。

2. 嗅觉阈值检测

采用梯度浓度香叶腈（1:160、1:80、1:40、1:20、1:10）依次刺激，由低浓度至高浓度逐级测试，每根棉签刺激1 min，组间间隔1 min，同步设置矿物油空白对照。通过VisuTrack统计不同浓度下小鼠嗅觉探索时长，判定小鼠可稳定感知气味的最低阈值浓度，为后续辨别实验筛选适宜刺激浓度。

3. 嗅觉习惯化-去习惯化测试

筛选高于嗅觉阈值的稳定浓度（1:20）开展辨别实验：同一气味连续刺激5次（香叶醇），每次1 min、间隔1 min，记录小鼠随刺激重复出现的探索时长衰减规律，即嗅觉习惯化；随后切换全新气味（香叶腈）连续刺激5次，小鼠探索时长显著回升，即为去习惯化（气味辨别）。全程无人工干预，软件自动量化行为数据。

五、VisuTrack软件数据采集与分析标准

软件精准识别有效嗅觉行为：鼻尖靠近气味源、嗅探、近距离探查等有效探索行为，排除远距离游荡、静止、攀爬等无效行为。核心统计指标：各批次刺激嗅探总时长、单次探索时长、探索衰减率、新气味回弹增幅。

统计学采用重复测量方差分析，以刺激次数为组内因素、组别为组间因素，结合Tukey或Bonferroni事后检验，分别判定习惯化显著性（同气味逐次衰减）与去习惯化显著性（新气味显著回升），P＜0.05为差异具有统计学意义。

六、实验质控要点

全程统一通风、光照、温湿度环境；单次刺激更换全新气味棉签，废弃材料密封收纳；梯度浓度严格统一配比，避免挥发不均导致浓度偏差；实验顺序固定为先阈值、后辨别，保证嗅觉感知基线稳定；依托VisuTrack自动化分析，彻底解决人工计时误差、行为判定标准不统一、数据可重复性差等传统实验痛点。

参考文献

[1] Wesson D W, et al. Habituation-dishabituation olfactory testing in mice[J]. Journal of Visualized Experiments, 2008, (18): e877.

[2] Yang M, et al. Behavioral assays for olfactory function in rodents[J]. Nature Protocols, 2011, 6(11): 1789-1802.

[3] 上海欣软. 动物嗅觉行为学检测技术规范[Z]. 2024.

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