Nat Biotechnol | 赵天萌团队以模块化设计重塑att位点实现大片段DNA的高效精准插入

大片段DNA的高效、精准定点插入，是细胞与基因治疗实现治疗性基因稳定整合、以及作物精准育种聚合多性状的共同技术基础。位点特异性重组酶能够识别一对短DNA序列（ attB 与 attP ）并催化二者间的定向重组，因其不依赖外源DNA修复因子，被视为实现大片段基因插入的重要工具。既往提高重组酶活性的努力主要集中在酶蛋白本身，通过定向进化或人工智能辅助设计来增强催化能力；然而，定点插入的效率不仅由酶决定，也受其天然识别的 att 位点制约。

2026年9月2日，北京齐禾生科生物科技有限公司Kevin Zhao（赵天萌）团队在Nature Biotechnology在线发表题为Engineered genomicattachment sites for site-specific recombinases enable high-efficiency integration in plants and human cells的研究论文。该工作首次将重组酶的天然识别位点本身作为工程化对象，通过对Bxb1的att序列进行模块化重组与高通量筛选融合，在人细胞和植物两套体系中同步提升了大片段DNA的定点插入效率。工程化位点 attB (V111)与蛋白质变体组合后，靶向CD19的 CAR 基因和鸟氨酸氨甲酰基转移酶（ OTC ）基因在人细胞中的定点整合效率可达 约30% ；在中国杂交水稻骨干亲本缘88S的稳定转化中，耐除草剂基因的定点插入效率达到24%。

Bxb1能够同时识别 attB 和 attP 的左右半位点，并以四聚体形式完成重组反应；其在四个半位点上的结合动力学并不完全相同，提示 att 位点并非不可改变的固定元件，而存在系统优化的空间。据此，研究人员将天然 att 序列中参与识别的部分拆分为若干模块，尝试把已知天然位点中最有利的序列元件重新组合，从而绕开海量的随机筛选、直接构建结合更稳定、重组效率更高的嵌合 att 位点。

研究团队首先在烟草叶片中搭建基于荧光素酶的定量重组报告系统，对系统性重新组合的嵌合位点进行概念验证。在此基础上，设计了覆盖全部可能模块组合的144种 attB 序列（ attB (V1)至 attB (V144)），并在人基因组位点上逐一评估其整合活性。结果显示，全部144种 attB 序列均能被Bxb1识别；其中超过70%的工程化位点整合效率高于野生型 attB 。活性最高的 attB (V111)在HEK293T细胞中的重组效率达51.9%，约为野生型 attB 的1.7倍；在水稻原生质体中达35.6%，约为野生型的4.4倍。上述结果表明，对天然识别序列进行模块化重组和理性设计，可在人细胞与植物细胞中有效提升Bxb1介导的大片段DNA的插入活性。

在位点工程化之外，研究团队也对Bxb1蛋白本身进行了针对性优化。为避免改造DNA结合界面可能带来的脱靶隐患，他们将NNK饱和突变集中在Bxb1的催化区域，并在烟草叶片中搭建了真核高通量重组酶筛选系统，通过双T-DNA重组结合二代测序富集高活性变体，获得了分别适用于人细胞和植物的高活性单突变体Bxb1_V76C与Bxb1_R2Q。实验显示，位点变体与蛋白变体之间可产生叠加效应，二者结合可进一步提高大片段DNA的定点插入活性。

在作物育种上，团队将优化后的位点与蛋白变体整合为一套一体化质粒递送策略并应用于水稻。通过一次转化，即可将一段水稻内源耐草甘膦 OsEPSPS 突变 体 基因盒精确导入基因组预设靶位点。在缘88S稳定转化群体中，24%的再生植株获得了预期的精准插入。研究人员从多个维度验证了整合事件的准确性与稳定性：双端边界高通量测序显示供体DNA整合至预期靶位点，Oxford Nanopore三代长读长测序证实插入片段完整、未见重排且不存在嵌合，全基因组二代测序未检出任何脱靶整合；对两个独立T1株系的遗传分析表明，插入等位基因可按孟德尔方式稳定传递至后代。

一体化质粒递送策略及耐除草剂水稻创制（图 1 ）

研究团队设计的大片段插入策略同样适用于细胞与基因治疗。工程化位点 attB (V111)与蛋白变体Bxb1_V76C联合使用后，靶向CD19的CAR基因和鸟氨酸氨甲酰基转移酶（OTC）基因在人细胞中的定点整合效率分别可达31%与25%。此外，新获得的高活性单突变体还显著增强了不依赖CRISPR的Bxb1变体在人基因组安全港位点介导供体DNA整合的活性。这些结果表明，该体系可用于治疗性大片段基因在临床相关位点的安全、定点整合。

这项研究将重组酶优化的思路从单纯提升蛋白质活性，拓展到重组酶与其识别位点的协同改良，为提升大片段DNA定点插入效率提供了一条不依赖DNA结合界面改造的新路径。天然 att 识别序列经模块化理性设计与系统筛选后可与蛋白变体形成互补，也为该平台的持续迭代留下了空间。从应用角度看，同一套 “ DNA-centric ” 设计原则能在人体细胞与单子叶作物间直接迁移，为细胞与基因治疗、作物性状聚合及合成生物学提供了可复用的通用工具基础。

齐禾生科首席执行官赵天萌博士为论文通讯作者，齐禾生科科学家闫林林博士为第一作者。齐禾生科研发团队周玲瑜、高强、李丽娟、郭丽娜、冉毅东、张立肖、张康、王志伟、李妍和李盛楠等在课题研究中做出了重要贡献。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41587-026-03294-y

制版人： 十一

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