Nature | 黏连蛋白重塑复制叉接触促进复制叉减速与逆转

撰文丨易

DNA复制叉在癌症化疗等复制应激条件下会减慢甚至逆转，这种可塑性是细胞耐受损伤、完成基因组完整复制的关键。复制叉的启动与推进发生在三维组织的基因组中，黏连蛋白复合体（SMC1、SMC3、RAD21与STAG1/2）通过DNA环挤出将基因组组织成TAD与染色质环，并参与复制起始位点的定位；虽然此前有报道未受扰动的复制中姊妹叉之间存在瞬时接触，但应激条件下复制叉之间接触的功能意义以及黏连蛋白在其中的作用仍不清楚。

近日，瑞士苏黎世大学Massimo Lopes和Daniel González-Acosta、与西班牙国家癌症研究中心Ana Losada团队在Nature期刊发表题为Cohesin reshapes replication fork contacts to aid fork slowing and reversal的研究论文，发现环挤出态的黏连蛋白在停滞的复制叉处聚集，将新生DNA的三维接触从姊妹叉偶联重塑为复制子之间的长程接触，并通过抑制PRIMPOL的作用促进复制叉的主动减速与逆转，揭示了复制应激响应并非孤立调节事件的叠加，而是经由黏连蛋白环挤出在全基因组拓扑层面整合的过程。

研究团队首先用新生DNA蛋白分离联用质谱（iPOND-MS）刻画复制叉蛋白质组，设两种羟基脲处理：2 mM处理2小时严重耗竭核苷酸库、使所有复制叉完全停滞，100 µM处理1小时则通过轻度核苷酸削减与活性氧解除PRDX2寡聚化诱导复制叉减速。完全停滞时，SMC1、SMC3、RAD21、STAG2、NIPBL与Sororin等黏连蛋白组分与FANCD2/I、BLM、RAD51等应激因子一同显著富集在新生DNA上；减速条件下招募的因子较少，但STAG2、NIPBL、SMC3与Sororin仍显著富集。邻近连接实验（SIRF）以羟基脲、Aphidicolin与丝裂霉素C等多种叉停滞药物验证了这一结果，并通过γH2AX与pATM分析排除了双链断裂导致黏连蛋白聚集的可能。利用生长素诱导降解技术构建的NIPBL快速降解细胞系显示，NIPBL缺失可完全取消黏连蛋白在停滞叉处的聚集，而染色质上黏连蛋白总量仍保留75%至90%，排除了装载缺陷的解释；Sororin与WAPL的缺失不影响黏连蛋白向停滞叉的招募，排除了黏连建立与去载调控的参与；为排除TAD结构破坏的间接效应，团队又用CTCF降解细胞系验证CTCF缺失虽削弱TAD但不影响黏连蛋白向停滞叉的招募，说明NIPBL依赖的装载与环挤出是黏连蛋白在停滞叉积累的必要条件。

为直接观察应激下新生DNA的基因组接触，研究团队开发了基于Micro-C的新方法Repli-C：以EdU标记15分钟锁定新合成的前几千碱基，经点击反应连接地高辛后，以控制程度的MNase消化、富集含新生DNA的染色质接触后建库测序。Repli-C图谱在复制起点处检出喷泉样结构（fountain-like structures），对应相互偶联的姊妹叉，且仅存在于Repli-C而不见于平行Micro-C，证实其为复制特异结构；喷泉出现的位置由聚合酶使用测序（Pu-seq）定义的复制叉分叉位点确认。在SMC1可快速降解的细胞中，黏连蛋白缺失使喷泉数量增多、长度延伸，说明静息条件下黏连蛋白限制姊妹叉偶联的扩展；羟基脲处理则在有无黏连蛋白时均缩短喷泉，提示应激下存在黏连蛋白依赖与不依赖的两类接触共同限制姊妹叉靠近，同时羟基脲诱导的新接触聚集于对角线附近的复制子内区域，这一效应依赖黏连蛋白，在高分辨Repli-seq定义的起始区同样可见；羟基脲还诱导依赖黏连蛋白的条纹信号，提示停滞的复制叉成为环挤出的屏障，把邻近复制子的复制叉连接起来。团队进一步利用区分黏连蛋白两种功能的突变体解析机制：SMC13D丧失姊妹染色单体黏连但保留环挤出，SMC14E则相反；仅SMC14E不能在停滞叉处积累，长期替换后TAD、环与绝缘相关表型也只能被野生型而无法被SMC14E完全恢复，且SMC14E细胞中复制子之间的叉接触在静息时即显著减少、应激后仅轻微增加，证明环挤出而非黏连是黏连蛋白锚定停滞叉并建立复制子间接触的关键。

在功能层面，DNA纤维实验显示低剂量羟基脲、丝裂霉素C或低浓度Aphidicolin仅在黏连蛋白存在时减慢复制叉，急性降解RAD21或NIPBL后复制叉推进不再受限，回补野生型SMC1可恢复减速而SMC14E不能；BRCA2缺失细胞的新生DNA降解是复制叉逆转的间接读出，该降解在RAD21或NIPBL缺失时消失，且可被野生型SMC1与SMC13D而非SMC14E恢复，电子显微镜直接证实NIPBL缺失或表达SMC14E的细胞中逆转叉比例严重下降。S1核酸酶敏感性实验表明黏连蛋白缺失细胞的DNA合成是不连续的，其原因是PRIMPOL介导的再引发失控：黏连蛋白或NIPBL缺失使PRIMPOL在停滞叉处进一步增多，敲低PRIMPOL即可消除不受限的DNA合成，并恢复BRCA2缺失细胞的叉降解，而敲低RECQ1解旋酶无效，说明黏连蛋白缺失时逆转叉根本无法形成；长期克隆形成实验中，NIPBL缺失或表达SMC14E的细胞对低剂量应激药物更为敏感，敏感程度与直接灭活逆转酶SMARCAL1相当，证实黏连蛋白环挤出帮助细胞应对长期的基因毒性治疗。

综上所述，本研究鉴定了环挤出态黏连蛋白在复制应激响应中的新功能：它锚定在停滞的复制叉附近，限制姊妹叉偶联、建立复制子间接触，通过抑制PRIMPOL的失控再引发使复制叉得以主动减速与逆转，从而维持基因组稳定。

https://doi.org/10.1038/s41586-026-11034-0

制版人： 十一

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