FSHW | 黑米花青素通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路增强抗氧化剂并延长寿命

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Introduction

花青素是一类黄酮类化合物，其基本结构为2-苯基-4H-苯并吡喃，并带有多羟基与多乙氧基取代基团，广泛存在于水果、蔬菜、花卉及谷物中。黑米花青素（BRA）的含量虽不及果蔬，但其在全球范围内的广泛食用性与高抗氧化活性，促使我们对其开展进一步研究。研究发现，黑米花青素可通过上调胰岛素信号通路中DAF-16基因的表达，延长线虫寿命并改善机体氧化应激状态。研究证实，黑米花青素可调节高脂饮食C57BL/6J小鼠的胆固醇代谢，并改善其肠道菌群失调。尽管目前已对黑米花青素在体内的自由基清除与抗氧化作用开展研究，但其延长寿命的具体作用机制仍未阐明。

磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（PKB/Akt）信号通路作为经典的抗凋亡、促存活信号通路，已被证实对抗衰老发挥关键作用。雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是一种保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与调控细胞生长、衰老与代谢过程。自噬相关蛋白及溶酶体含量降低是衰老的主要特征。mTOR可直接作用于自噬相关基因（Atg）蛋白，调控自噬体形成，同时可下调4E结合蛋白（4E-BP）1与核糖体S6激酶（S6K）的表达。然而，mTOR调控的自噬与衰老之间的关联机制尚不明确，仍需进一步深入研究。

本研究采用HUVEC，探究BRA对过氧化氢（H₂O₂）诱导的血管内皮细胞功能障碍及血管壁细胞损伤的保护作用。此外，以黑腹果蝇为模式生物（该模型常用于多种抗氧化活性及PI3K/Akt/mTOR信号通路相关研究），考察BRA干预对其肠道健康的保护效应及延长寿命的作用机制，并结合分子对接与网络药理学方法解析PI3K/Akt/mTOR信号通路的调控机制。研究结果提示，黑米花青素或可作为膳食补充剂应用于哺乳动物的抗衰老干预。

Results

BRA活性成分靶点的网络药理学预测

KEGG通路富集分析显示，PI3K-Akt通路与mTOR通路是BRA发挥作用的关键通路（图1A）。基于相关基因数量，筛选出BRA靶点蛋白GO富集分析中生物学过程（BP）、细胞组分（CC）与分子功能（MF）的前10位结果（图1B）。其中，生物学过程（BP）占比最高（74.47%），细胞组分（CC）占比8.51%，分子功能（MF）占比17.02%，后两者占比较小（图S2）。本研究构建了“黑米花青素-靶点-通路”关联网络图（图1C）。网络药理学结果提示，BRA可能通过关键靶点mTOR、4E-BP，以及PI3K/Akt与mTOR关键通路发挥抗衰老作用。

图1 KEGG通路分析（A）；GO富集分析的生物学过程（BP）、细胞组分（CC）与分子功能（MF）部分（B）；黑米花青素（BRA）-成分-通路-靶点网络图（C）

BRA对HUVEC与黑腹果蝇氧化损伤的缓解作用

过氧化氢处理可显著降低超氧化物歧化酶（SOD）与过氧化氢酶（CAT）活性，并升高丙二醛（MDA）含量。与之相反，100 µg/mL BRA处理组的SOD与CAT活性分别提升67.74%（P＜0.01）与62.26%（P＜0.01），MDA水平则降低17.30%（P＜0.05）（图2A–C）。该结果与30 µg/mL BRA处理PC12细胞的研究结果相似。如图2D所示，BRA可显著缓解过氧化氢诱导的细胞毒性，100 μg/mL BRA处理组的细胞存活率提升27%（P＜0.01）。与过氧化氢损伤组相比，磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶/磷脂酰肌醇3-激酶（p-PI3K/PI3K）与磷酸化蛋白激酶B/蛋白激酶B（p-Akt/Akt）的蛋白表达水平略有升高（图2H–I），而该效应可被特异性抑制剂LY294002抑制（图2G），提示BRA可能通过调控PI3K-Akt信号通路发挥细胞氧化损伤保护作用。LY294002的加入可导致活性氧（ROS）水平升高（图2E–F），并降低BRA处理组的细胞存活率（图2J），进一步证实BRA通过PI3K-Akt通路调控ROS水平，从而发挥抗氧化作用。

图2 BRA对H₂O₂诱导的HUVEC中SOD活性（A）、CAT活性（B）及MDA含量（C）的保护作用；细胞存活率（D）；ROS定量分析（E）与ROS积累情况（F）；p-Akt/Akt及p-PI3K/PI3K的蛋白免疫印迹分析（G–I）；以及细胞存活率（J）

BRA对黑腹果蝇生理活性的影响

寿命是评估黑腹果蝇衰老最简单且常用的指标。如图3A所示，浓度为0.5、1.5和4.5 mg/mL的BRA处理组，果蝇寿命曲线分别延长7.14%（P＜0.05）、9.4%（P＜0.05）和15.1%（P＜0.01），该结果与280 μg/mL黑米花青素提取物（BRAE）延长线虫寿命的研究结果相似。尽管果蝇的运动能力会随年龄增长自然下降，但雌蝇经4.5 mg/mL BRA饲料饲喂30和45 d后，其爬行能力分别提升9.8%和2.3%（图3B），该结果与3 mg/mL山楂提取物改善果蝇运动能力的效应相近。4.5 mg/mL BRA处理组果蝇在饥饿应激、热应激、过氧化氢应激及百草枯应激下的存活时间均显著延长，分别提升21.43%、62.5%、27.3%和13%（图3C–F）。BRA对果蝇的摄食量与体重无显著影响（图3G–H），但可显著抑制其产卵量，4.5 mg/mL BRA组产卵量降至294枚（P＜0.001）（图3I），提示果蝇可通过延长寿命维持繁殖能力。

图3 BRA对黑腹果蝇生理活性的影响

BRA改善黑腹果蝇肠道稳态

BRA处理后，雌蝇在30和45 d龄时的“蓝精灵（Smurf）”个体数量均下降（图4A），表明BRA可缓解衰老果蝇的肠道屏障功能障碍（0.5、1.5、4.5 mg/mL BRA组的Smurf率分别降低0.50%～9.09%、1.50%～22.73%、4.50%～31.82%），对果蝇肠道屏障具有保护作用，这与氢化MagH₂延缓“蓝精灵”表型出现的效应相似。4.5 mg/mL BRA处理可使肠道菌群的ACE、ENT、LMRS指标分别降低76.13%、52.17%、45.98%（图4B），提示BRA通过抑制肠道微生物的异常增殖来改善肠道稳态。在0.5～4.5 mg/mL BRA干预下，溶酶体荧光强度呈梯度上升，增幅为5%～47%（图4C、F）。ESG细胞数量的减少表明，BRA可改善衰老果蝇肠道干细胞（ISCs）的异常增殖（图4D、E），该结果与山楂提取物抑制衰老果蝇肠道干细胞异常增殖的研究结论一致。上述结果共同表明，BRA可促进肠道溶酶体生成，进而维持肠道结构与功能稳定，最终延缓衰老进程。

图4 BRA对黑腹果蝇肠道稳态的影响

BRA提高黑腹果蝇抗氧化酶活性并降低MDA含量

花青素对果蝇寿命的影响与其抗氧化特性密切相关。BRA可不同程度地提升果蝇体内SOD与CAT的活性（图5D–E），并呈剂量依赖性地降低MDA含量，降幅分别为4.07%～15.35%、9.26%～27.26%与23.46%～24.62%（图5F）。该效应与枸杞多糖及本研究中HUVEC细胞的实验结果相似。

图5 黑腹果蝇的基因表达水平

BRA对黑腹果蝇基因表达的影响

4.5 mg/mL BRA干预可使果蝇体内SOD1、SOD2和CAT的mRNA表达水平分别上调32%、27%和31%（图5A）。在4.5 mg/mL BRA处理下，雌蝇体内4E-BP基因表达水平上调48%，而PI3K、Akt、mTOR和S6K基因表达水平则显著下调（P＜0.01）（图5A–B）。同时，Atg1、Atg5、Atg8a和Atg8b的基因表达水平也被显著上调（图5C）。上述结果表明，BRA可通过抑制mTOR通路相关基因的表达来延长果蝇寿命。

BRA在黑腹果蝇RNAi品系中的分子机制验证

与野生型果蝇相比，各RNAi品系果蝇的寿命均显著缩短（图6A–K），而Sir2 RNAi品系果蝇的寿命则有所延长（图6L）。Sir2基因沉默并未影响Sir2RNAi品系果蝇的摄食量（图S3），提示其寿命延长效应可能并非由Sir2基因调控。BRA干预对Atg1、Atg5、Atg8a和Atg8b RNAi品系果蝇的溶酶体荧光强度无显著影响（图5G–H），进一步证实BRA介导的溶酶体形成过程与自噬通路密切相关。

图6 黑腹果蝇RNAi品系中的分子机制

基于分子对接的BRA延长黑腹果蝇寿命的作用机制

本研究选取4E-BP、Atg8a和Akt蛋白，与C3D、C3G和P3G进行分子对接分析。通过观察二维图中的靶点相互作用力及三维图中的整体结合构象（图7A–C）可见，C3G、C3D和P3G与各靶点蛋白的结合位点周围分布着以下氨基酸残基：4E-BP蛋白：ASP164、LYS134、LYS141、LEU167、GLU136、LYS213、CYS168。Atg8a蛋白：ARG70、SER71、GLU549、ASN314、LYS317、ARG70、LEU313、LYS61。Akt蛋白：LYS279、ASP407、ASN394、GLY273、LEU272、GLU393、GLU350、LYS391、PHE557、VAL280、LYS274、LYS295。上述活性成分与靶点蛋白主要通过氢键、范德华力、烃键及其他疏水键实现结合。其中，P3G与4E-BP的最低结合能为-128.716 kcal/mol，C3G与Atg8a的最低结合能为-213.56 kcal/mol，C3G与Akt的最低结合能为-134.888 kcal/mol。

图7 P3G、C3G、C3D与4E-BP（A）、Atg8a（B）及Akt（C）蛋白的分子对接结果

Conclusion

本研究通过实验证实，黑米花青素（BRA）具有较强的抗氧化活性：在人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中，BRA可减轻过氧化氢诱导的细胞损伤，并上调p-PI3K与p-AKT蛋白表达；在黑腹果蝇体内，BRA可通过上调抗氧化相关基因表达、下调mTOR信号通路并激活自噬，实现延长寿命、提升爬行能力及保护肠道健康的作用。上述机制同时通过计算机分子模拟与网络药理学分析得到验证。鉴于人类基因的高度保守性，黑米花青素（BRA）有望作为一种潜在的膳食补充剂，用于改善机体健康、延长寿命。

Black rice-anthocyanin enhanced antioxidants and extended lifespan by inhibiting the PI3K/AKT/mTOR pathway

Xiaoyan Sanga,1, Rui Liua,1, Tiantian Tanga, Qingdai Liua, Zhiwei Wanga, Huiyong Lianb,*, Jianhui Liuc, Ye Zhanga,*, Hao Wanga,*

a State Key Laboratory of Food Nutrition and Safety, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China

b College of Food Science and Engineering, Hainan Tropical Ocean University, Sanya 572022, China

c Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety, Jiangsu Province Engineering Research Center of Edible Fungus Preservation and Intensive Processing, College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210023, China

1 Both authors contributed equally.

*Corresponding author.

Abstract

This study aimed to investigate the anti-aging effects of black rice-anthocyanin (BRA) in Drosophila melanogaster and HUVEC cells. In this study, the strong antioxidant activity of BRA in HUVEC cells, D. melanogaster of lifespan extension, and molecular mechanism were elucidated. Firstly, the BRA increased enzyme activities of superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT), as well as the expression of phosphatidyl inositol 3-kinase (PI3K)/protein kinase B (Akt) protein while decreasing the accumulation of reactive oxygen species (ROS) and malondialdehyde (MDA) in both H2O2-induced HUVEC cells and D. melanogaster. Secondly, the BRA extended the lifespan of D. melanogaster by improving crawling ability and intestine abilities in the microbial environment, barrier function, and number of autophagic lysosomes, as well as inhibiting the abnormal multiplication of stem cells in the intestine. Thirdly, the BRA downregulated expression levels of Akt-1 and mTOR in D. melanogaster while upregulated downstream autophagy gene expression levels of Atg1, Atg5, Atg8a, and Atg8b, as well as the expression levels of SOD, CAT, and 4E-binding protein. Lastly, the anti-aging mechanism was also verified by both the computerized molecular simulation and network pharmacology. Thus, the prolonged lifespan of D. melanogaster by blocking the mTOR pathway and activating autophagy, which could be further used for improving health and prolonging life.

Reference:

SANG X Y, LIU R, TANG T T, et al. Black rice-anthocyanin enhanced antioxidants and extended lifespan by inhibiting the PI3K/AKT/mTOR pathway[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(8): 9250180. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250180.

翻译： 田雨欣 （实习）

编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇

封面图片：摄图网

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