翻译组学联合应用解析之超高分辨率Ribo-seq × 免疫肽质谱，从非经典翻译到肿瘤新生抗原挖掘

一、传统注释之外，隐藏着怎样的翻译世界？

传统基因注释通常将研究重点集中在已知蛋白编码区。然而，越来越多研究发现，5′UTR、3′UTR、lncRNA、circRNA、假基因及其他未注释区域同样可能发生翻译。

这些非经典翻译事件可产生小肽、微肽及其他未注释翻译产物，共同拓展传统蛋白数据库之外的“暗蛋白组”。其中部分短肽经过细胞内加工后，可与人类白细胞抗原（HLA）分子结合并呈递于细胞表面，进而被免疫系统识别。

在肿瘤细胞中，基因突变、异常剪接、融合转录本、转录失调和非经典翻译还可能产生肿瘤特异性HLA呈递肽，为肿瘤新生抗原发现及免疫治疗靶点开发打开新的研究空间。

二、为什么传统方法容易遗漏小肽与暗蛋白？

常规蛋白质组学通常依赖已注释蛋白数据库进行检索，对短开放阅读框（sORF）和非经典开放阅读框（ncORF）编码产物的覆盖有限。潜在翻译产物可能来源于：

· 5′UTR中的上游开放阅读框及下游开放阅读框

· lncRNA、circRNA及其他传统非编码RNA

· 假基因转录本、基因间区及未注释转录区域

· 非AUG起始、重叠开放阅读框和移码开放阅读框

· 肿瘤突变、异常剪接、融合转录本及不同阅读框

由于这些ORF往往长度较短、表达量较低，其翻译产物也可能快速降解，因此很难仅依赖常规蛋白质组学进行全面检测。

重要认识快速降解并不等于没有生物学意义。部分不稳定翻译产物可被加工成短肽并进入HLA抗原呈递通路，成为免疫系统感知细胞状态的重要信号。

三、超高分辨率Ribo-seq：敏锐发现非经典翻译

Ribo-seq通过测序核糖体保护片段，在全转录组范围内捕获正在被核糖体翻译的RNA区域。高质量Ribo-seq数据具有清晰的三碱基周期性，可在密码子分辨率上解析翻译活动。

新使生物超高分辨率Ribo-seq技术具有极高的5'端精度和更清晰的三碱基周期性，不仅能够分析已知蛋白编码区的翻译效率，还可用于识别：

· uORF、下游ORF及其他短开放阅读框

· lncRNA、circRNA等来源的非经典ORF

· 非AUG翻译起始位点

· 重叠ORF、移码ORF及转录本异构体相关ORF

· 肿瘤特异性非经典翻译事件及候选小肽编码区域

Ribo-seq回答哪些RNA区域正在被核糖体翻译？这些区域可能产生什么样的肽段？

点击图片查看超高分辨率Ribo-seq技术详细介绍

四、免疫肽质谱：直接检测细胞表面的HLA呈递肽

免疫肽质谱又称免疫肽组学，通常通过免疫沉淀富集HLA-肽复合物，将结合于HLA分子上的短肽释放后进行高分辨率LC-MS/MS检测。

与常规蛋白质组学关注完整蛋白不同，免疫肽质谱直接分析细胞表面真实呈递的HLA结合肽。以HLA-I为例，其呈递肽通常来源于细胞内蛋白及翻译产物的加工降解，并可被CD8⁺ T细胞识别。

免疫肽质谱回答哪些翻译产物经过加工后，真正以短肽形式呈递到了细胞表面？

五、两项技术联合，建立“翻译—呈递”证据链

Ribo-seq与免疫肽质谱分别从翻译层和抗原呈递层提供证据。基于样本自身的Ribo-seq数据构建个性化候选肽数据库，可突破传统蛋白数据库的注释边界，并提高非经典HLA呈递肽的发现能力。

新使生物专业翻译组学平台提供微蛋白、微肽及肿瘤新生抗原挖掘与鉴定技术服务，深度整合超高分辨率Ribo-seq、全转录组测序、蛋白质谱与免疫肽质谱等技术，系统发现非经典开放阅读框及其翻译产物，构建从“转录—翻译—肽段鉴定—HLA呈递验证”到候选肿瘤新生抗原筛选的完整证据链，为暗蛋白组研究及肿瘤免疫治疗靶点开发提供一站式技术支持。

点击图片查看小肽/肿瘤新抗原挖掘与鉴定技术详细介绍

01发现翻译事件：Ribo-seq识别具有核糖体占位和三碱基周期性的经典及非经典ORF。

02建立候选序列库：结合RNA-seq、基因组或转录本信息，生成样本特异性ORF及候选肽数据库。

03检测HLA呈递肽：通过HLA免疫沉淀和LC-MS/MS获得样本真实免疫肽谱。

04多层证据筛选：整合质谱匹配、HLA分型、肿瘤/正常对照及免疫原性信息，获得高可信候选抗原。

核心看点Ribo-seq发现“哪些区域正在翻译”，免疫肽质谱确认“哪些肽段被HLA真实呈递”，两者联合构建从非经典翻译到免疫识别的完整证据链。

六、联合鉴定小肽、微肽与暗蛋白

Ribo-seq构建候选肽库，免疫肽质谱验证真实呈递的小肽

超高分辨率Ribo-seq能够以极高精度识别短ORF的翻译活动，免疫肽质谱则可检测其中进入HLA呈递通路的短肽。两者联合能够拓展传统蛋白数据库边界，提升低丰度、非经典来源小肽的发现能力。

概念边界小肽、微肽和HLA呈递肽并不完全等同。部分非经典ORF可编码具有稳定结构或独立功能的微蛋白；另一些翻译产物可能不稳定，但其降解片段仍可进入抗原加工与呈递通路。

七、在肿瘤研究中，进一步指向肿瘤新生抗原

超高分辨率Ribo-seq与免疫肽质谱联合应用示意图

并不是所有小肽或暗蛋白都是肿瘤新生抗原。候选肽需要经过多层证据筛选，才能进一步判断其肿瘤免疫学价值。理想候选通常需要满足：

· 来源于肿瘤样本中的活跃翻译事件

· 能够被患者HLA分子真实呈递

· 在正常组织中缺失或表达极低，具有较好的肿瘤特异性

· 与患者HLA分型匹配并具有较强结合潜力

· 能够诱导抗原特异性T细胞反应，具备实验验证的免疫原性

因此，超高分辨率Ribo-seq和免疫肽质谱构成的是“发现与验证”平台；若要确认新生抗原，还应结合肿瘤/正常对照、HLA分型、结合预测以及T细胞功能实验。

从暗基因组到暗蛋白组通过超高分辨率Ribo-seq与免疫肽质谱联合，让隐藏的翻译产物成为可发现、可验证、可开发的潜在免疫治疗靶点。

八、联合技术的核心优势

◆拓展数据库边界以样本自身翻译信息构建候选数据库，减少因参考数据库缺失造成的漏检。

◆获得双层证据Ribo-seq证明候选ORF正在翻译，免疫肽质谱证明其来源肽段被HLA真实呈递。

◆提升小肽发现能力重点覆盖短ORF、非经典ORF及低丰度翻译事件，深入解析暗蛋白组。

◆直接面向肿瘤免疫靶点结合正常对照、HLA分型及免疫原性分析，筛选个体化或共享型肿瘤抗原。

◆连接基础研究与临床转化候选抗原可进一步用于肿瘤疫苗、TCR-T及抗原特异性T细胞研究。

九、推荐应用方向

1. 小肽、微肽及暗蛋白组发现

2. 非经典ORF及短ORF鉴定

3. lncRNA、circRNA与uORF翻译研究

4. HLA-I呈递肽图谱构建

5. 非经典肿瘤抗原与肿瘤新生抗原筛选

6. 个体化肿瘤疫苗及TCR-T靶点研究

7. 药物、应激或治疗诱导的抗原呈递变化研究

8. 肿瘤与正常组织免疫肽组比较

新使生物专业翻译组学技术平台

新使生物NeoRibo长期专注于翻译组学技术研发与应用，已构建覆盖核糖体翻译、tRNA解码、RNA修饰及Poly(A)尾调控等多个层面的技术体系，提供从整体翻译活性、基因翻译效率到密码子分辨率翻译行为的系统解决方案，全面解析转录后及翻译过程中的精细调控机制。

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