Angew | 张帅等团队开发生物正交探针，揭示蛋白质“维C化“的细胞图谱与动态调控

维生素C如何影响细胞功能？作为人体必需的微量营养素，维生素C的抗氧化作用及其作为多种酶辅因子的功能已被广泛研究。近年来，蛋白质赖氨酸维生素C化修饰（lysine vitcylation，简称“维C化”）的发现，为理解这一经典营养分子的作用方式打开了新的窗口：维生素C还可以通过共价修饰直接作用于蛋白质，将营养与代谢信息传递至蛋白质功能层面。然而，这一修饰在细胞中涉及哪些蛋白质、呈现怎样的空间分布，又如何受到细胞调控，仍有待系统探索。缺乏能够兼顾标记、富集和成像的化学工具，是制约这一领域发展的重要因素。

近日，华中农业大学张帅、浙江大学朱成梁和上海交通大学医学院附属瑞金医院何吓俤等团队联合在Angew杂志在线发表题为Bioorthogonal Vitamin C Probes Enable Cellular Profiling and Investigation of Lysine Vitcylation 的研究论文。研究团队开发了用于维C化的生物正交探针平台，结合定量化学蛋白质组学、荧光成像与全基因组CRISPR-Cas9筛选，绘制了活细胞中的维C化候选靶标图谱，揭示了探针标记的核仁富集及快速动态变化，并鉴定出谷胱甘肽S-转移酶P1（GSTP1）这一上游调控因子。该研究为维C化从个别蛋白质的修饰鉴定走向细胞尺度的系统研究提供了关键工具，也为探索维生素C通过共价修饰参与细胞功能与疾病调节奠定了研究基础。

建立活细胞维C化研究的化学工具

为实现对维C化相关蛋白的标记与追踪，研究团队在维生素C的3位羟基位置引入体积较小的炔丙基，合成了报告探针VC-1。该探针保留了维生素C的核心内酯骨架，并可通过铜催化叠氮—炔环加成反应连接荧光基团或生物素，进而开展荧光检测、亲和富集及质谱分析。

为验证这一设计，研究团队首先以合成肽为底物，通过串联质谱鉴定到VC-1来源的赖氨酸加合物。以天然维生素C为对照，串联质谱分析表明，VC-1同样能够在模型肽的赖氨酸残基上形成共价加合物，支持其保留天然维生素C的赖氨酸反应能力。在细胞裂解液中，VC-1进一步表现出浓度依赖性的蛋白标记，且过量天然维生素C能够竞争性降低标记信号，为其用于发现维C化候选靶标提供了实验依据。

然而，VC-1在完整细胞中的标记效率有限。针对这一瓶颈，团队通过O-乙酰化掩蔽VC-1的剩余羟基，构建前体探针VC-2，以改善细胞递送。VC-2进入细胞后，其乙酰保护基经酯键水解被脱除，从而释放原型报告分子VC-1。与VC-1相比，VC-2在多种哺乳动物细胞中实现了有效、浓度依赖性的蛋白标记，天然维生素C竞争实验也显示，部分标记信号可被竞争性降低，支持其用于活细胞维C化研究。

从候选图谱到功能线索：解析维C化候选靶标及其细胞分布

利用VC-2开展活细胞定量化学蛋白质组学分析，并以天然维生素C竞争作为进一步筛选条件，研究团队获得了1615个竞争敏感的维C化候选靶标。这些蛋白显著富集于核糖核蛋白复合体的生物发生、非编码RNA加工和RNA剪接等过程，提示维C化可能与RNA代谢网络存在此前尚未充分认识的联系。

团队随后结合免疫沉淀、荧光检测和LC–MS/MS，在FTO、ALDH1B1、GSTO1、IMPDH1等代表性蛋白上鉴定到探针来源的赖氨酸加合物，为候选靶标提供了直接的位点证据。这一候选图谱为后续验证内源性维C化靶标及研究其生理功能提供了资源。

那么维C化修饰蛋白在细胞内如何分布？荧光成像显示，VC-2来源的蛋白标记主要富集于细胞核，并形成明显的核内斑点，与核仁标志蛋白Fibrillarin共定位。这一空间特征与候选靶标在核糖核蛋白生物发生及RNA加工通路中的富集相互呼应。进一步利用放线菌素D抑制转录后，Fibrillarin发生分散，探针标记信号却仍保留为清晰的核内斑点。这提示，标记可能与相对稳定的核仁结构或RNA加工复合物相关，为探索维C化与核仁组织之间的联系提供了线索。

RNA测序进一步发现，在所测试条件下，维生素C处理对整体转录本丰度的影响相对有限，却伴随广泛的可变剪接变化，相关转录本的功能富集也涉及RNA代谢与染色质调控。考虑到维生素C具有多种生物学作用，这些变化尚不能直接归因于维C化；但蛋白质组学、成像和转录组学结果的相互呼应，为检验维C化是否参与RNA加工调控提供了明确方向。

快速变化的维C化标记：GSTP1参与上游调控

除空间分布外，研究还发现了一个引人关注的动态特征：活细胞中的VC-2标记信号在1—2小时内迅速积累，随后明显下降；相比之下，细胞裂解液中的标记则较为稳定。这一差异提示，细胞内标记的变化可能涉及主动调控过程。

为系统寻找调控因子，团队将探针荧光标记与流式分选相结合，开展全基因组CRISPR-Cas9筛选，鉴定到GSTP1等影响标记水平的因子。GSTP1缺失提高整体探针标记水平，过表达则降低标记水平；自制泛维C化赖氨酸抗体的检测结果，也支持GSTP1缺失增强天然维生素C诱导的修饰信号。

脉冲追踪实验进一步理清了GSTP1的作用环节：GSTP1缺失主要提高初始标记水平，而移除探针后的相对衰减动力学没有明显改变。因此，GSTP1更可能调节维C化的形成或积累，而非直接负责修饰的去除。结合GSTP1在亲电物质解毒和氧化还原调节中的已知功能，研究提出，它可能通过影响维生素C衍生的反应性物种的可用性、反应性或存续时间，在维C化形成的上游发挥作用。这一模型将维C化与细胞亲电物质处理及氧化还原稳态联系起来，其具体分子机制仍需进一步研究。

这项研究建立了集标记、富集、成像和功能筛选于一体的维生素C化修饰研究平台，并揭示其候选靶标的空间组织和动态调控特征。该平台为进一步检验维C化修饰在RNA加工、代谢调节及疾病相关过程中的作用提供了工具基础，也为理解营养代谢物如何通过共价修饰参与蛋白质调控拓展了研究路径。

华中农业大学张帅教授、浙江大学朱成梁研究员和上海交通大学医学院附属瑞金医院何吓俤研究员为文章的共同通讯作者。华中农业大学博士研究生王婉婷、浙江大学博士研究生丁宝丽和华中农业大学博士研究生杨淑乔、 李雪洁为文章共同第一作者。

原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.2501228

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