江苏
miRNA加尾逆转录与荧光定量非常适合研究多个miRNA、需高通量测序及筛选的实验，下面就跟着小编一起先来了解一下miRNA加尾逆转录及荧光定量的内容吧！
首先，我们先来了解一下miRNA加尾逆转录原理：
该原理是通过PolyA聚合酶（PAP）在miRNA的3’端后面添加一条PolyA尾巴，增加其长度，改造成 mRNA的结构， 再将逆转录引物 Oligo d(T) 结合到PolyA序列上，在逆转录酶的作用下完成加长版cDNA的合成。下图所示即是miRNA加尾逆转录过程哦~
下面，我们一起来看一下miRNA加尾法逆转录及荧光定量实验的常见问题：
1、如何提高miRNA加尾法的逆转录效率？
miRNA加尾法的逆转录效率主要依赖于Poly A酶的活性和Oligo d(T)引物的结合效率。研究者可以选择BIOG的miRNA加尾逆转录试剂盒，盒内配置有工程优化的 Poly A 聚合酶，具有很高的加尾效率，能够高效快速地给miRNA 加上腺苷酸尾巴并提高miRNA的稳定性，同时为cDNA的合成提供Oligo d(T)引物结合位点，搭配百代特别设计的含 Oligo d(T)的引物，能够与 miRNA Poly A+高效结合，从而有效提高miRNA加尾法的逆转录效率。
2、miRNA加尾法逆转录的特点及应用？
其主要特点就是可以对样本中所有miRNA进行无差别逆转录，属于高通量逆转录，一次逆转录可检测多种miRNA，因此加尾法适用于多个miRNA (3个以上)的研究，即大量miRNA前期的筛选，因为一次逆转录可以进行多个miRNA的qPCR扩增，节省样本量的同时也更加方便。
3、miRNA加尾法逆转录和荧光定量实验中有哪些注意事项？
A.逆转录实验中，模板miRNA使用量范围可在 10pg~2ug 之间，即使提取的miRNA浓度低也可有效进行逆转录；如提取miRNA含量本身就低的样本，如血清、血浆等，则无需测浓度，可在提取后直接进行逆转录；
B.在荧光定量实验操作中，对于未稀释的cDNA模板，加样体积最好不超过2.0uL，对于丰度较高的miRNA，cDNA样本可适当稀释后再进行qPCR，稀释倍数可根据反应CT值而定；
C.miRNA逆转录试剂盒和miRNA qPCR试剂盒一般是配套的，研究者最好买同一公司配套的miRNA 逆转录试剂和qPCR试剂，否则，有可能出现失败的实验结果。其主要原因是逆转录引物上往往设计有PCR引物结合序列，如果买不同厂家的试剂，PCR引物可能无法特异地结合逆转录产物。百代生物可提供miRNA加尾法逆转录试剂盒及配套的荧光定量试剂盒，并可为研究者免费设计miRNA上下游引物。
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