Advanced Science I 卡格列净不止降糖：通过“肠菌-蜜二糖-GLO1”轴缓解糖尿病肾小球内皮损伤！(秦贵军/赵艳艳—郑大一附院)

2026年5月21日，郑州大学第一附属医院秦贵军、赵艳艳团队，联合上海交通大学医学院附属瑞金医院、郑州大学天健先进生物医学实验室及多家临床中心，在Advanced Science（中科院1区，Journal Impact Factor=14.1）在线发表题为 “Canagliflozin Alleviates Diabetic Glomerular Endothelial Injury via Melibiose in a Microbiota-Dependent Manner” 的研究论文。该文于 2025年9月3日投稿，2026年4月12日修回，2026年5月21日接收。 期刊影响因子信息见 Wiley 期刊页面。

该研究聚焦糖尿病肾病（DKD）中“白蛋白尿—肾小球内皮损伤—肠道菌群代谢物”之间的联系。作者在 85 例接受卡格列净治疗的 DKD 患者和 85 例对照患者中随访 26 周，发现卡格列净不仅降低尿白蛋白/肌酐比值（UACR），还可重塑肠道菌群，显著富集 Roseburia intestinalis，并提高血浆 蜜二糖（melibiose） 水平。动物实验进一步显示，卡格列净可改善 DKD 小鼠肾小球内皮窗孔结构、内皮完整性及白蛋白尿；而抗生素清除肠道菌群后，这一保护作用明显减弱，提示其肾脏保护效应具有菌群依赖性。

机制研究显示，活 R. intestinalis 可促进蜜二糖生成，而蜜二糖能够直接结合并激活 乙二醛酶1（GLO1），降低甲基乙二醛水平，进而抑制 AGE-RAGE 信号通路，减轻糖尿病状态下的肾小球内皮损伤。作者还通过 GLO1 过表达、敲低和内皮特异性敲除实验进一步证明，蜜二糖对肾小球内皮的保护作用依赖于 GLO1。最后，一项 12 周探索性临床研究显示，补充蜜二糖前体 水苏糖 可升高 DKD 患者血浆蜜二糖水平，并降低 UACR、循环甲基乙二醛、TNF-α 和 IL-6。

总体而言，该研究提出了卡格列净发挥肾脏保护作用的一条新路径：卡格列净重塑肠道菌群，富集 R. intestinalis，促进蜜二糖生成；蜜二糖激活 GLO1 并抑制 AGE-RAGE 通路，从而保护肾小球内皮并降低白蛋白尿。这一发现不仅拓展了对 SGLT2 抑制剂肾脏保护机制的理解，也为 DKD 早期干预提供了“肠-肾轴”方向的新思路。

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【摘要】

卡格列净在降低血糖之外，还可减少糖尿病肾病（DKD）患者的白蛋白尿，但其具体机制尚不清楚。本研究纳入接受卡格列净治疗的 85 例患者和 85 例对照患者，并随访 26 周，以探索肠道微生物组及其代谢物是否参与肾脏保护作用。结果显示，卡格列净可重塑肠道菌群，尤其富集 Roseburia intestinalis，并提高血浆蜜二糖（melibiose）水平。在小鼠中，卡格列净可缓解肾小球内皮损伤和白蛋白尿。粪菌移植、补充 Roseburia intestinalis 或给予蜜二糖，均可模拟类似保护效应。机制上，蜜二糖可结合并激活乙二醛酶 1（GLO1），降低甲基乙二醛水平，抑制 AGE-RAGE 通路，从而维持肾小球内皮完整性。此外，口服蜜二糖前体补充剂可降低早期 DKD 患者的白蛋白尿。上述发现提示，肠-肾轴可能参与卡格列净的肾脏保护作用，蜜二糖也可能成为 DKD 的潜在干预策略。

01

研究背景及科学问题

糖尿病肾病（DKD）是糖尿病最常见的微血管并发症之一，也是全球终末期肾病的重要原因。持续性白蛋白尿是 DKD 的典型特征，反映了肾小球滤过屏障在结构和功能上的损伤。其中，肾小球内皮损伤被认为是 DKD 发生发展中的早期且关键事件，会导致肾小球通透性增加，并促进白蛋白尿出现。尽管传统治疗已经取得进展，DKD 进展的残余风险仍然较高，这提示有必要开发能够直接靶向早期肾小球内皮功能障碍的新策略。

钠-葡萄糖协同转运蛋白 2 抑制剂（SGLT2i）卡格列净已在 DKD 患者中显示出明确的肾脏保护作用，可显著降低白蛋白尿并延缓肾功能下降。值得注意的是，卡格列净除了通过抑制肾脏葡萄糖重吸收发挥经典作用外，还被发现可调节肠道葡萄糖代谢并重塑肠道菌群组成，从而影响宿主碳水化合物代谢。这种相互作用提示，肠-肾轴可能参与介导卡格列净的治疗获益。近年来，肠道菌群被认为是 DKD 病理生理过程的重要参与者。肠道菌群可产生多种进入全身循环的代谢物，并直接影响肾脏细胞功能。由于肾小球内皮持续暴露于血液循环，它可能是感知并响应肠源性代谢物的关键界面。

在多种肠道菌群来源代谢物中，碳水化合物类化合物是一类重要的生物活性分子，在宿主与菌群互作中发挥重要作用。蜜二糖是一种微生物来源的二糖，近年来因其潜在的抗炎、抗氧化作用以及益生元功能而受到关注。然而，蜜二糖及其他菌群来源碳水化合物在肾小球内皮功能和 DKD 中的作用仍缺乏系统研究。

本研究旨在探讨卡格列净对 DKD 患者和 DKD 小鼠模型肠道微生物组及代谢组的调控作用，评估菌群来源代谢物对肾小球内皮损伤的保护作用，并进一步鉴定其分子靶点。通过揭示参与卡格列净抗蛋白尿效应的肠-肾轴互作，本研究为 DKD 靶向治疗提供了新的认识。

02

重要发现及亮点

卡格列净重塑 DKD 患者肠道菌群，并改善 DKD 小鼠肾小球内皮损伤

研究首先建立了一个多中心临床队列，包括接受卡格列净治疗的患者和未接受 SGLT2i 治疗的对照患者。两组基线糖化血红蛋白（HbA1c）相近，但经过 26 周治疗后，卡格列净组尿白蛋白/肌酐比值（UACR）显著下降。16S rRNA 测序显示，卡格列净组 Chao1 指数没有明显差异，但 Simpson 指数升高，提示菌群均匀度增加；同时，肠道菌群整体结构也发生改变。在线性判别分析中，多种菌属在两组之间存在显著差异，其中 Roseburia 与肾脏指标关系密切，尤其与 UACR 呈明显负相关。

在 DKD 小鼠中，每日灌胃卡格列净 8 周后，空腹血糖下降，体重增加，UACR、肌酐和血尿素氮（BUN）改善。组织学结果显示，卡格列净可减轻肾小球肥大、系膜基质沉积和基底膜增厚。透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）进一步显示，卡格列净可恢复肾小球内皮窗孔结构。内皮标志物 CD31 在 DKD 小鼠中降低，而卡格列净治疗后得到恢复。同时，卡格列净上调紧密连接和内皮完整性相关蛋白 ZO-1、OCLN 以及糖萼核心蛋白 SDC1，并降低损伤相关标志物 ET-1 和 ICAM-1。小鼠肠道菌群分析也显示，卡格列净增加 Roseburia 等有益菌群，使菌群结构更接近健康对照，并且 Roseburia 丰度同样与 UACR 呈负相关。这些结果提示，肠道菌群，尤其是 Roseburia，可能参与卡格列净对肾小球内皮损伤的保护作用。

图1：卡格列净重塑 DKD 中的肠道菌群并改善肾小球内皮损伤。（A）接受卡格列净治疗的 DKD 患者（CANA 组，n = 85）和对照患者（CON 组，n = 85）的临床研究流程图。研究在基线和干预后采集血液、尿液和粪便样本。（B，C）卡格列净治疗患者（n = 85）和对照患者（n = 85）的 HbA1c（B）和 UACR（C）水平。（D）基于 Bray-Curtis 距离的主坐标分析（PCoA）显示 CANA 组和 CON 组之间的肠道菌群组成差异。每个点代表一个样本，红色表示 CON 组，蓝色表示 CANA 组。（E）采用线性判别分析效应量识别 CON 组和 CANA 组之间丰度差异显著的菌群分类单元（LDA > 2，p < 0.05）。红色和蓝色分别表示在 CON 组和 CANA 组富集的菌属。（F）Pearson 相关分析用于评估所选细菌相对丰度与临床参数之间的关系。（G）卡格列净干预实验方案。雄性 DKD 小鼠接受 20 或 40 mg kg−1 卡格列净或 PBS 灌胃 8 周，年龄匹配的非 DKD 对照小鼠给予 PBS。（H）小鼠 UACR 水平（n = 8）。（I）H&E、Masson 三色和 PAS 染色代表性图像，显示 DKD 相关肾小球病理改变。比例尺，20 µm。（J）TEM 和 SEM 代表性图像，显示 DKD 相关肾小球内皮损伤。比例尺，500 nm。（K）基于 TEM 图像对单位长度内皮细胞窗孔密度进行形态计量学定量（n = 3）。（L）基于 SEM 图像对内皮细胞窗孔面积密度进行形态计量学定量（n = 3）。（M）肾小球免疫荧光代表性图像，显示 DKD 小鼠中 CD31（红色）标记内皮细胞，DAPI（蓝色）标记细胞核。比例尺，50 µm。（N）DKD 小鼠肾小球 CD31 荧光强度定量分析（n = 3）。（O）肾脏中 ZO-1、ICAM-1、OCLN、SDC1 和 ET-1 蛋白的代表性免疫印迹结果（n = 4）。（P）基于 Bray-Curtis 距离的 PCoA 显示 NC、DKD 和 CANA 组之间的肠道菌群组成。每个点代表一只小鼠（n = 8）；灰色、红色和蓝色分别表示 NC、DKD 和 CANA 组。（Q）采用线性判别分析效应量识别 NC、DKD 和 CANA 组之间丰度差异显著的菌群分类单元（LDA > 2，p < 0.05）。（R）基于 16S rRNA 测序的小鼠 Roseburia 相对丰度（n = 8）。（S）NC、DKD 和 CANA 组中 Roseburia 相对丰度与 UACR 之间的线性回归分析（n = 8）。数据以中位数和四分位间距（B、C）以及均值 ± 标准差（H、K、L、N、R）表示。统计分析采用 Mann-Whitney U 检验（B、C）和单因素方差分析（H、K、L、N、R）。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，ns p > 0.05。

肠道菌群参与卡格列净对肾小球内皮损伤的保护作用

为了进一步验证肠道菌群是否介导卡格列净的保护作用，研究者在 DKD 小鼠中使用广谱抗生素混合物（Abx）清除肠道菌群，再给予卡格列净治疗。抗生素预处理 2 周后，小鼠肠道菌群基本被清除。菌群清除对血糖没有显著影响，但部分削弱了卡格列净引起的轻度体重增加。更重要的是，菌群清除明显削弱了卡格列净降低 UACR 的作用，并降低了其改善 DKD 小鼠肾小球内皮损伤的效果。

随后，研究者进行粪菌移植（FMT）实验。来自接受卡格列净治疗或未治疗 DKD 小鼠的粪便被移植至抗生素处理后的 DKD 受体小鼠。16S rRNA 测序显示，受体小鼠与供体小鼠的肠道菌群结构几乎完全重叠。移植来自卡格列净治疗小鼠的菌群后，受体小鼠空腹血糖下降，体重未受明显影响，同时 UACR 和肌酐水平降低，BUN 未出现显著变化。更重要的是，接受卡格列净供体菌群的小鼠肾小球内皮损伤明显改善。这些结果进一步支持：卡格列净重塑后的肠道菌群参与其肾小球内皮保护作用。

图2：肠道菌群参与卡格列净对 DKD 小鼠肾小球内皮损伤的保护作用。（A）实验方案示意图，显示 DKD 小鼠（CANA）和抗生素混合物诱导的伪无菌 DKD 小鼠（Abx + CANA）接受卡格列净（40 mg kg−1）治疗 8 周。DKD 对照小鼠给予 PBS（DKD）。（B）小鼠 UACR 水平（n = 6）。（C）H&E、Masson 三色和 PAS 染色代表性图像，显示 DKD 相关肾小球病理改变。比例尺，20 µm。（D）TEM 和 SEM 代表性图像，显示肾小球内皮窗孔结构。比例尺，500 nm。（E）基于 TEM 图像对单位长度内皮细胞窗孔密度进行形态计量学定量（n = 3）。（F）基于 SEM 图像对内皮细胞窗孔面积密度进行形态计量学定量（n = 3）。（G）肾脏中 ZO-1、ICAM-1、OCLN、SDC1 和 ET-1 蛋白的代表性免疫印迹结果（n = 4）。（H）粪菌移植（FMT）实验方案。来自 DKD 和 CANA 供体小鼠的粪便上清液被移植到抗生素混合物诱导的伪无菌 DKD 受体小鼠体内，持续 8 周。（I）基于 Bray-Curtis 距离的 PCoA 显示供体小鼠（DKD 和 CANA 组）以及受体小鼠（FMT-DKD 和 FMT-CANA 组）之间的肠道菌群组成。每个点代表一只小鼠（n = 4）；红色和蓝色分别表示 DKD 和 CANA 供体，绿色和黄色分别表示 FMT-DKD 和 FMT-CANA 受体。（J–L）小鼠 UACR（J）、Cr（K）和 BUN（L）水平（n = 8）。（M）H&E、Masson 三色和 PAS 染色代表性图像，显示 DKD 相关肾小球病理改变。比例尺，20 µm。（N）TEM 和 SEM 代表性图像，显示肾小球内皮窗孔结构。比例尺，500 nm。（O）基于 TEM 图像对单位长度内皮细胞窗孔密度进行形态计量学定量（n = 3）。（P）基于 SEM 图像对内皮细胞窗孔面积密度进行形态计量学定量（n = 3）。（Q）肾脏中 ZO-1、ICAM-1、OCLN、SDC1 和 ET-1 蛋白的代表性免疫印迹结果（n = 3）。数据以均值 ± 标准差表示（B、E、F、J–L、O、P）。统计分析采用单因素方差分析（B、E、F）和非配对双尾 Student t 检验（J–L、O、P）。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，ns p > 0.05。

活 Roseburia intestinalis 缓解 DKD 小鼠肾小球内皮损伤

临床和小鼠结果均显示，卡格列净可增加 Roseburia 丰度，并且该菌属与 UACR 密切相关。为了进一步明确具体菌种，研究者分析了 16S rRNA 测序注释出的两个 Roseburia 菌种：Roseburia intestinalis 和 Roseburia inulinivorans。结果显示，卡格列净组中显著增加的是 R. intestinalis，而不是 R. inulinivorans。即使校正其他降糖药物使用情况后，这一增加仍具有统计学意义。同时，R. intestinalis 与 UACR 呈明显负相关。定量 PCR 进一步证实，DKD 患者在卡格列净治疗后 R. intestinalis 增加，小鼠数据也呈现一致趋势。

为了验证 R. intestinalis 的功能作用，研究者给 DKD 小鼠补充活 R. intestinalis 或热灭活 R. intestinalis。活 R. intestinalis 能够成功定植于肠道，而热灭活菌不能。活 R. intestinalis 可降低小鼠体重，但不影响空腹血糖；同时显著降低 UACR、肌酐和 BUN，而热灭活菌没有类似作用。组织病理和电镜图像显示，活 R. intestinalis 可改善肾小球损伤。肾脏蛋白分析进一步显示，活菌组损伤标志物下降，而内皮完整性相关标志物升高。这些结果提示，活 R. intestinalis 可通过维持肾小球内皮状态来降低白蛋白尿。

图3：卡格列净促进 R. intestinalis 富集，活 R. intestinalis 改善 DKD 小鼠肾小球内皮损伤。（A）基于 16S rRNA 测序的 CON 组和 CANA 组 Roseburia 相对丰度。（B）基于 16S rRNA 测序的 CON 组和 CANA 组 R. intestinalis 相对丰度。（C）基于 16S rRNA 测序的 CON 组和 CANA 组 R. inulinivorans 相对丰度。（D）治疗后 R. intestinalis 相对丰度与 UACR 之间关联的线性回归分析。（E，F）pre-CANA 和 post-CANA 组人粪便中 R. intestinalis 相对丰度（n = 30）（E），以及 DKD 和 CANA 组小鼠粪便中 R. intestinalis 相对丰度（n = 5）（F）。（G）R. intestinalis 干预实验方案。SPF 级 DKD 小鼠每日一次口服无菌甘油（DKD）、活 R. intestinalis（Live R.i）或热灭活 R. intestinalis（HK R.i），持续 8 周，剂量为每只小鼠每 0.2 mL 含 1 × 10^9 CFU。（H）Live R.i 和 HK R.i 组小鼠粪便中 R. intestinalis 相对丰度（n = 6）。（I，J）小鼠空腹血糖（I）和体重（J）水平（n = 6）。（K–M）小鼠 UACR（K）、Cr（L）和 BUN（M）水平（n = 6）。（N）H&E、Masson 三色和 PAS 染色代表性图像，显示 DKD 相关肾小球病理改变。比例尺，20 µm。（O）TEM 和 SEM 代表性图像，显示肾小球内皮窗孔结构。比例尺，500 nm。（P）基于 TEM 图像对单位长度内皮细胞窗孔密度进行形态计量学定量（n = 3）。（Q）基于 SEM 图像对内皮细胞窗孔面积密度进行形态计量学定量（n = 3）。（R–W）肾脏中 ET-1（S）、SDC1（T）、OCLN（U）、ICAM-1（V）和 ZO-1（W）蛋白的代表性免疫印迹（R）及定量分析（n = 3）。数据以均值 ± 标准差表示（A–C、F、H–M、P、Q、S–W）。统计分析采用配对双尾 Student t 检验（E）、非配对双尾 Student t 检验（F、H）、双因素方差分析（I、J）和单因素方差分析（K–M、P、Q、S–W）。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，ns p > 0.05。

菌群代谢物蜜二糖缓解糖尿病肾小球内皮损伤

考虑到菌群与宿主之间的交流很大程度上由生物活性代谢物介导，研究者采用超高效液相色谱广泛靶向代谢组学，分析接受或未接受卡格列净治疗的 DKD 患者血浆代谢变化。正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）显示，两组代谢谱可明显分离。由于饮食和微生物来源的碳水化合物在宿主-菌群互作中具有重要作用，研究者重点关注这类代谢物。在变化最显著的代谢物中，肠道菌群来源的二糖蜜二糖在卡格列净治疗后显著升高，并且与 UACR 呈最强负相关。此外，队列中蜜二糖水平与 R. intestinalis 丰度呈正相关。

在 DKD 小鼠中，靶向代谢组学进一步证实，口服卡格列净可显著提高血浆蜜二糖水平。抗生素介导的菌群清除可消除这一效应，而 FMT 可使其恢复。活 R. intestinalis 定植可进一步升高血浆蜜二糖水平，而 PBS 或热灭活菌则不能；体外培养的 R. intestinalis 也能释放高于培养基背景水平的蜜二糖。进一步分析提示，β-果糖苷酶可能参与这一代谢过程。卡格列净治疗后，患者粪便中 R. intestinalis 来源 β-果糖苷酶基因表达显著升高。研究者还构建了过表达 R. intestinalis 来源 β-果糖苷酶基因 gly32 的重组 E. coli MG1655gly32 菌株，结果显示，与野生型相比，gly32 过表达菌株在培养 24 小时后产生蜜二糖的能力显著增强。这些证据提示，蜜二糖可能是 R. intestinalis 来源的关键代谢物，并参与卡格列净的肾脏保护效应。

为了评估蜜二糖在体内的肾脏效应，研究者每日给予 DKD 小鼠蜜二糖灌胃 8 周。蜜二糖不影响空腹血糖，但可减少体重增加、降低白蛋白尿并改善肾功能。进一步观察显示，蜜二糖明显减轻肾小球损伤，恢复内皮窗孔结构，并维持肾小球内皮完整性。与此一致，蜜二糖上调内皮保护相关蛋白，并下调损伤标志物。这些获益在高脂饮食（HFD）联合链脲佐菌素（STZ）诱导的另一种糖尿病模型中也得到重复验证。体外实验显示，在人肾小球内皮细胞（HGECs）中，25 或 50 µM 蜜二糖可增强 ZO-1 和 OCLN 表达，抑制 ET-1 和 ICAM-1，并减少高糖诱导的活性氧（ROS）积累，同时不影响细胞活力。这些结果表明，蜜二糖能够保护肾小球内皮细胞，并缓解 DKD 背景下的内皮功能障碍。

图4：卡格列净诱导的肠道菌群代谢物蜜二糖改善肾小球内皮细胞损伤。（A）正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）显示 post-CON 组（n = 85）和 post-CANA 组（n = 85）的代谢物分布。post-CON 组以红色显示，post-CANA 组以蓝色显示。（B）按 p 值筛选出的前 10 个差异代谢物的 Log2 倍数变化（log2FC），显示 CON 组和 CANA 组内治疗前后比较。红色和蓝色分别表示 CON 组和 CANA 组。（C）Pearson 相关热图，用于评估所选代谢物相对水平与临床参数之间的关系。（D）post-CON 和 post-CANA 组中蜜二糖与 R. intestinalis 相对丰度之间的线性回归分析。（E）CANA 给药后小鼠血浆中蜜二糖浓度（n = 7–8）。（F）伪无菌小鼠接受 CANA 后血浆中蜜二糖浓度（n = 6）。（G）伪无菌小鼠接受 FMT 后血浆中蜜二糖浓度（n = 8）。（H）给予 R. intestinalis 后小鼠血浆中蜜二糖浓度（n = 6）。（I）R. intestinalis 培养上清液中蜜二糖浓度（n = 4）。（J）pre-CANA 和 post-CANA 组人粪便中 R. intestinalis 来源 β-果糖苷酶的相对丰度（n = 30）。（K）野生型和 gly32 过表达 E. coli MG1655 菌株培养 24 小时后，上清液中蜜二糖浓度（n = 4）。（L）蜜二糖干预实验方案。雄性 DKD 小鼠接受 0.5 或 1.0 g kg−1 蜜二糖或 PBS 灌胃 8 周，年龄匹配的非 DKD 对照小鼠给予 PBS。（M，N）小鼠空腹血糖（M）和体重（N）水平（n = 8）。（O–Q）小鼠 UACR（O）、Cr（P）和 BUN（Q）水平（n = 8）。（R）H&E、Masson 三色和 PAS 染色代表性图像，显示 DKD 相关肾小球病理改变。比例尺，20 µm。（S）TEM 和 SEM 代表性图像，显示 DKD 相关肾小球内皮损伤。比例尺，500 nm。（T）基于 TEM 图像对单位长度内皮细胞窗孔密度进行形态计量学定量（n = 3）。（U）基于 SEM 图像对内皮细胞窗孔面积密度进行形态计量学定量（n = 3）。（V）肾小球免疫荧光代表性图像，显示 DKD 小鼠中 CD31（红色）标记内皮细胞，DAPI（蓝色）标记细胞核。比例尺，20 µm。（W）DKD 小鼠肾小球 CD31 荧光强度定量分析（n = 3）。（X）肾脏中 ZO-1、ICAM-1、OCLN、SDC1 和 ET-1 蛋白的代表性免疫印迹结果（n = 4）。数据以均值 ± 标准差表示（E–I、K、M–Q、T、U、X）。统计分析采用单因素方差分析（E–H、O–Q、T、U、X）、非配对双尾 Student t 检验（I、K）、配对双尾 Student t 检验（J）和双因素方差分析（M、N）。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，ns p > 0.05。

蜜二糖直接结合 GLO1 并增强其酶活性

为了阐明机制，研究者在高糖条件下对蜜二糖处理的 HGECs 进行 RNA 测序。结果显示，蜜二糖处理显著降低糖尿病并发症中经典内皮功能障碍驱动通路 AGE-RAGE 信号通路的富集。随后，研究者检测了 AGE-RAGE 信号通路下游关键因子 TNF-α 和 IL-6。结果显示，蜜二糖显著降低糖尿病小鼠血浆和肾脏 mRNA 中 TNF-α、IL-6 水平，也降低高糖处理 HGECs 培养上清液中的 TNF-α 和 IL-6。结合蜜二糖下调 ET-1 和 ICAM-1 的结果，进一步支持其对 AGE-RAGE 轴的抑制作用。

为了识别蜜二糖的直接靶点，研究者采用药物亲和反应靶点稳定性（DARTS）联合质谱分析，筛选出 72 个候选蛋白。考虑到 GLO1 可解毒甲基乙二醛，而甲基乙二醛是晚期糖基化终末产物（AGEs）的前体，研究者将 GLO1 作为重点靶点。DARTS 和细胞热转变实验（CETSA）提示，蜜二糖处理后 GLO1 的蛋白水解抵抗性和热稳定性增加。微量热泳动（MST）进一步证实，蜜二糖可与 GLO1 直接相互作用，解离常数 Kd 为 3.48 ± 0.43 µM。

功能上，蜜二糖在高糖条件下显著增强 GLO1 酶活性，但不改变其蛋白表达。与此一致，HGECs 和糖尿病小鼠肾组织中的甲基乙二醛水平均下降。GLO1 过表达可缓解高糖诱导的肾小球内皮损伤；相反，GLO1 敲低会降低其表达和酶活性，加重内皮损伤，并削弱蜜二糖的保护作用。分子对接预测显示，蜜二糖可能通过与 GLO1 的 R38、N104、E111、K157 和 M158 位点形成氢键结合。进一步突变实验显示，蜜二糖可恢复表达野生型、E111A、K157A 或 M158A GLO1 细胞中的 GLO1 活性，但不能恢复 R38A 或 N104A 突变体中的活性。这提示蜜二糖可能主要通过 R38 和 N104 位点与 GLO1 相互作用，从而发挥保护效应。

此外，研究者还评估蜜二糖是否也通过 GLO1 保护其他肾小球细胞。结果显示，GLO1 在肾小球内皮细胞中的表达高于足细胞和系膜细胞。在高糖条件下，蜜二糖同样可缓解足细胞和系膜细胞损伤，但作用弱于 HGECs；当 GLO1 被敲低后，这种保护作用明显减弱。上述结果提示，蜜二糖通过 GLO1 介导的保护机制可能存在于多类肾小球细胞中，但以内皮细胞中的作用最为突出。

图5：蜜二糖直接结合 GLO1 并增强其酶活性。（A）基于 HGEC 转录组数据，对糖尿病并发症中 AGE-RAGE 信号通路进行基因集富集分析（GSEA）。（B）采用 DARTS 方法识别蜜二糖结合蛋白的流程示意图。（C）DARTS 实验代表性免疫印迹及定量结果，显示蜜二糖与 GLO1 之间的结合（n = 3）。（D）CETSA 实验代表性免疫印迹及定量结果，评估有无蜜二糖处理时不同温度下 GLO1 的稳定性（n = 3）。（E）微量热泳动（MST）实验显示蜜二糖与 GLO1 的直接结合亲和力。（F）HGECs 中 GLO1 酶活性（n = 3）。（G）HGECs 中甲基乙二醛水平（n = 3）。（H，I）小鼠肾脏中甲基乙二醛水平（n = 5–6）。（J–O）GLO1 过表达后，HGECs 中 GLO1（K）、ET-1（L）、OCLN（M）、ICAM-1（N）和 ZO-1（O）蛋白的代表性免疫印迹（J）及定量分析（n = 3）。（P–U）GLO1 敲低后，HGECs 中 GLO1（Q）、ET-1（R）、OCLN（S）、ICAM-1（T）和 ZO-1（U）蛋白的代表性免疫印迹（P）及定量分析（n = 3）。（V）GLO1 敲低后 HGECs 中 GLO1 酶活性（n = 3）。（W）蜜二糖与 GLO1 的分子对接。图中展示结合构象概览，以及与 R38、N104、E111、K157 和 M158 残基相互作用的局部放大图。（X）在 GLO1 敲低 HGECs 中重新表达 GLO1 野生型和点突变体后的 GLO1 酶活性（n = 3）。数据以均值 ± 标准差表示（C、F–I、K–O、Q–V、X）。统计分析采用单因素方差分析（C、F–I、K–O、Q–U）和双因素方差分析（V、X）。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，ns p > 0.05。

蜜二糖对肾小球内皮的保护作用依赖于 GLO1

为了在体内明确 GLO1 的作用，研究者首先利用内皮特异性 Tie2 启动子驱动的 AAV2/9 载体，在肾小球内皮中过表达 GLO1。结果显示，内皮 GLO1 过表达不改变空腹血糖、体重或肌酐，但可降低白蛋白尿，并轻度降低 BUN；同时减少血浆 TNF-α 和 IL-6，限制肾脏甲基乙二醛积累，并改善肾小球内皮损伤和功能障碍。这提示 GLO1 在抵御糖尿病性肾小球内皮损伤中具有关键作用。

随后，研究者构建内皮特异性 GLO1 敲除小鼠，以进一步验证 GLO1 是否介导蜜二糖保护作用。GLO1 缺失不显著影响空腹血糖、体重、肌酐或 BUN，但会显著增加白蛋白尿，并加重糖尿病小鼠肾小球内皮损伤。更重要的是，与 GLO1fl/fl 小鼠相比，蜜二糖在 GLO1−/− 小鼠中无法降低白蛋白尿，也不能降低血浆 TNF-α、IL-6 和肾脏甲基乙二醛水平；其对肾小球内皮损伤的保护作用也在缺乏 GLO1 时被消除。

为进一步阐明肾脏 GLO1 在蜜二糖效应中的作用，研究者使用 AAV2/9-TIE-mir30-mCherry 特异性敲低糖尿病小鼠肾小球内皮细胞中的 GLO1。所得结果与 GLO1−/− 小鼠相似。因此，这些发现支持：蜜二糖对肾小球内皮的保护作用依赖于肾小球内皮细胞中的 GLO1。

图6：蜜二糖对肾小球内皮的保护作用由 GLO1 介导。（A）内皮细胞特异性 GLO1 敲除小鼠实验方案。雄性 GLO1fl/fl、cre−（GLO1fl/fl）小鼠和 GLO1fl/fl、cre+（GLO1−/−）小鼠喂养普通饲料（CON）或高脂饮食联合 STZ 诱导糖尿病。糖尿病小鼠接受蜜二糖（1.0 g kg−1，MEL）或 PBS（DM）处理。（B）示意图显示 Cre 介导 GLO1 等位基因中位于第 2 外显子两侧 loxP 位点之间的重组。重组导致第 2 外显子被切除，从而生成 GLO1 敲除等位基因。（C）内皮细胞特异性 GLO1 敲除小鼠基因分型。代表性琼脂糖凝胶电泳图显示 6 种基因型：Cre− 和 Cre+ 分别与 GLO1+/+、GLO1fl/+ 和 GLO1fl/fl 等位基因组合，基因组 DNA 来自 4 周龄小鼠尾组织。（D，E）小鼠空腹血糖（D）和体重（E）水平（n = 6）。（F–H）小鼠 UACR（F）、Cr（G）和 BUN（H）水平（n = 6）。（I）H&E、Masson 三色和 PAS 染色代表性图像，显示 DKD 相关肾小球病理改变。比例尺，20 µm。（J）TEM 和 SEM 代表性图像，显示肾小球内皮窗孔结构。比例尺，500 nm。（K）基于 TEM 图像对单位长度内皮细胞窗孔密度进行形态计量学定量（n = 3）。（L）基于 SEM 图像对内皮细胞窗孔面积密度进行形态计量学定量（n = 3）。（M–R）肾脏中 ET-1（N）、SDC1（O）、OCLN（P）、ICAM-1（Q）和 ZO-1（R）蛋白的代表性免疫印迹（M）及定量分析（n = 3）。（S–U）小鼠血浆 TNF-α（S）、血浆 IL-6（T）和肾脏甲基乙二醛（U）水平（n = 6）。数据以均值 ± 标准差表示（D–H、K、L、N–U）。统计分析采用单因素方差分析（F–H、K、L、N–U）和双因素方差分析（D、E）。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，ns p > 0.05。

蜜二糖前体在 DKD 患者中显示潜在干预价值

最后，研究者开展了一项为期 12 周的探索性临床研究，以评估蜜二糖用于 DKD 患者干预的潜在价值。由于食品级蜜二糖无法获得，研究者采用美国 FDA 认可为一般认为安全（GRAS）的蜜二糖前体水苏糖进行膳食补充，剂量为每日 2 次、每次 5 g。共有 19 例 DKD 患者完成研究，基线 UACR 为 30–1000 mg g−1，背景治疗保持不变。水苏糖显著升高血浆蜜二糖水平，并降低 UACR、循环甲基乙二醛、TNF-α 和 IL-6。研究还观察到 BMI、HbA1c 和尿酸轻度下降。DKD 小鼠模型中的结果也支持这一发现。总体来看，这些结果提示，蜜二糖可能具有用于 DKD 患者干预的潜在价值，但仍需更大样本、随机对照研究进一步验证。

图7：蜜二糖前体升高 DKD 患者血浆蜜二糖水平并减轻白蛋白尿。（A）接受水苏糖治疗的 DKD 患者（n = 19）临床研究流程图。研究在基线和干预后采集血液和尿液样本。（B）水苏糖治疗患者血浆蜜二糖水平（n = 19）。（C）水苏糖治疗患者 UACR 水平（n = 19）。（D–F）水苏糖治疗患者血浆甲基乙二醛（D）、TNF-α（E）和血浆 IL-6（F）水平（n = 19）。每个点代表一个样本，黑色和红色分别表示治疗前和治疗后（B–F）。统计分析采用配对双尾 Student t 检验（B、D–F）和 Wilcoxon 符号秩检验（C）。****p < 0.0001。

【贡献】★★★★★

本研究通过系统性分析揭示，卡格列净调节的肠道菌群在 DKD 干预中具有关键作用。尤其是 R. intestinalis 来源的蜜二糖可增强其蛋白靶点 GLO1 的活性，从而抑制 AGE-RAGE 信号通路，缓解肾小球内皮损伤，并最终降低 DKD 个体的白蛋白尿。研究还进一步提示，口服蜜二糖前体在早期 DKD 患者白蛋白尿干预中具有潜在价值，体现出一定的临床转化意义。整体而言，这些发现加深了对 DKD 中肠-肾轴作用的认识，并为临床缓解白蛋白尿提供了一个新的潜在干预方向。

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