Phytomedicine (1区) | 仙连解毒方靶向Plaur/Hbegf/EGFR轴，抑制结直肠癌肝转移与肌动蛋白骨架重塑！(程海波/孙洋团队-南...

2026年6月23日，南京中医药大学第一临床医学院、江苏省中医药防治肿瘤协同创新中心程海波校长团队、联合南京大学生命科学学院药物生物技术国家重点实验室孙洋教授团队等单位联合在Phytomedicine（中科院1区，IF=11.3）发表题为 “Xian-Lian-Jie-Du Decoction suppresses colorectal cancer liver metastasis by inhibiting Plaur/Hbegf/EGFR-mediated actin cytoskeleton remodeling” 的研究论文。

该研究聚焦结直肠癌肝转移（colorectal cancer liver metastasis，CRLM）这一临床难题，系统解析了仙连解毒方（Xian-Lian-Jie-Du Decoction，XLJDD）抑制肝转移的潜在作用机制。研究通过小鼠体内模型、细胞功能实验、转录组、蛋白组、单细胞RNA测序以及成分分析等多维度手段发现，XLJDD可通过靶向Plaur/Hbegf/EGFR相关通路，抑制肿瘤细胞肌动蛋白骨架重塑，并削弱恶性细胞与肿瘤相关巨噬细胞之间的Spp1-Cd44通讯。进一步研究还鉴定出cyclogalegenin是一种可进入肝转移组织并直接结合Plaur的XLJDD来源成分，为阐明中药复方抗结直肠癌肝转移的物质基础和机制提供了新的实验依据。

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【摘 要】

结直肠癌肝转移（CRLM）仍是临床治疗中的重要挑战。仙连解毒方（XLJDD）此前已显示出抗结直肠癌活性，但其在结直肠癌肝转移中的作用机制尚不清楚。

本研究旨在阐明XLJDD抑制肝转移的机制，并鉴定其靶向Plaur的活性成分。研究采用体内、体外实验，结合转录组、蛋白组和单细胞机制研究进行综合分析。研究人员通过脾内注射CT26细胞建立CRLM小鼠模型，并整合转录组和蛋白组数据筛选候选靶点；利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）描绘肿瘤微环境变化；通过划痕实验、Transwell实验、鬼笔环肽染色以及体内Plaur过表达救援模型进行功能验证。同时，研究采用UPLC-MS/MS分析XLJDD颗粒及其在生物样本中的来源成分，并通过分子对接、表面等离子共振（SPR）和微量热泳动（MST）验证其与Plaur的结合能力；进一步通过靶向UHPLC-MRM-MS/MS定量cyclogalegenin在肝组织中的暴露水平。

结果显示，XLJDD能够降低肝转移组织中的转移负荷。转录组与蛋白组整合分析提示，Plaur/Hbegf轴可能是XLJDD的重要作用靶点。机制上，Plaur促进Mmp9相关的Hbegf释放，而XLJDD可抑制EGFR/ERK信号，并降低Fscn1、Cdc42ep1等细胞骨架相关效应分子的表达。单细胞测序显示，XLJDD减少了Plaur高表达的Car6+恶性细胞亚群，增加了Ifit1+干扰素反应状态，并削弱了恶性细胞与Thbs1+肿瘤相关巨噬细胞之间的Spp1-Cd44信号。体内实验进一步表明，Plaur过表达会削弱XLJDD的抗转移作用。研究还鉴定出cyclogalegenin是一种可到达组织、能够直接结合Plaur并抑制CT26细胞Plaur表达的XLJDD来源成分；靶向定量进一步证实，口服XLJDD后cyclogalegenin可在肝转移组织中被检测到。

综上，XLJDD通过靶向Plaur、限制细胞骨架重塑并重塑转移性肿瘤微环境，从而抑制CRLM。Cyclogalegenin可能作为一种直接结合Plaur的成分参与这一作用。

01

研究背景及科学问题

结直肠癌（CRC）是全球范围内重要的健康负担。尽管外科手术和系统治疗不断进步，晚期结直肠癌患者的预后仍不理想。远处转移是结直肠癌相关死亡的主要原因，其中肝脏是最常见的转移部位。结直肠癌肝转移不仅取决于肿瘤细胞自身的恶性特征，也受到恶性细胞与肝脏肿瘤微环境（TME）之间动态互作的影响。这些互作可促进免疫逃逸、转移定植和治疗抵抗。因此，寻找可干预的关键靶点，并发展能够抑制肝脏转移生长的策略，仍是当前研究的重要方向。

中医药因其潜在的抑制肿瘤进展和调节宿主免疫作用，近年来在肿瘤辅助治疗研究中受到关注。仙连解毒方（XLJDD）是一种具有抗结直肠癌活性的中药复方。既往研究提示，XLJDD可通过调节代谢模式、恢复肠道菌群稳态来抑制结直肠癌进展；多组学研究也提示其在结直肠癌中具有广泛的调控效应。此外，网络药理学和实验研究表明，XLJDD可能通过多靶点、多通路发挥作用。然而，XLJDD抑制结直肠癌肝转移的机制仍不明确，尤其是在细胞骨架重塑、恶性细胞状态转换以及单细胞分辨率下肿瘤微环境重编程方面，仍缺乏系统阐释。

尿激酶型纤溶酶原激活物受体（uPAR）由PLAUR编码，是一种糖基磷脂酰肌醇锚定的膜受体，参与细胞外基质重塑和细胞内信号转导。PLAUR常在转移性实体瘤中上调，并与侵袭性表型相关。Plaur与细胞迁移、侵袭信号有关，而肌动蛋白细胞骨架重塑被认为是肿瘤转移行为的重要决定因素。在这一过程中，Rho家族GTP酶以及肌动蛋白束形成蛋白Fascin-1（Fscn1）是调节肌动蛋白动态变化、丝状伪足形成和细胞运动的关键因子。Plaur还可与表皮生长因子受体（EGFR）相关信号协同，进一步促进迁移和侵袭。因此，以Plaur为中心的信号网络可能是CRLM中具有治疗意义的脆弱环节。

在本研究中，作者整合转录组、蛋白组和单细胞RNA测序，探究XLJDD如何抑制CRLM。研究数据支持Plaur/Hbegf轴是XLJDD的候选作用靶点。机制上，XLJDD抑制Plaur相关信号，减少Mmp9相关的Hbegf释放，抑制EGFR/ERK激活，并下调Fscn1、Cdc42ep1等细胞骨架相关效应分子。单细胞分析进一步显示，XLJDD减少Plaur高表达的Car6+恶性细胞亚群，促进Ifit1+干扰素反应状态，并削弱恶性细胞与Thbs1+肿瘤相关巨噬细胞之间Spp1-Cd44介导的通讯。此外，研究鉴定出cyclogalegenin是一种可进入组织、直接结合Plaur并抑制CT26细胞Plaur表达的XLJDD来源成分。整体而言，这些发现为理解XLJDD抗结直肠癌肝转移作用提供了机制框架。

02

重要发现及亮点

仙连解毒方颗粒的化学成分谱与质量控制

为建立仙连解毒方的化学质量控制基础，研究人员采用UPLC-MS/MS对XLJDD颗粒制剂进行色谱分析。在正离子和负离子模式下均获得了代表性总离子流图，并在两种电离模式下共注释出40个特征峰。相应鉴定出的植物化学成分，包括化合物名称、m/z值、保留时间、加合离子和化学分类，列于补充表中。值得注意的是，本研究后续重点考察的Plaur结合成分cyclogalegenin被注释为第19号峰。这些结果为本研究所用XLJDD颗粒提供了化学成分谱和质量控制依据。

图1：仙连解毒方颗粒的化学成分谱与质量控制。（A）仙连解毒方颗粒在正离子模式下的代表性UPLC-MS/MS总离子流图。（B）负离子模式下的代表性UPLC-MS/MS总离子流图。根据保留时间和质谱鉴定结果，共注释出40个特征峰，其中峰1–20对应正离子模式，峰21–40对应负离子模式。相应鉴定出的植物化学成分列于补充表S2。Cyclogalegenin作为本研究进一步考察的Plaur结合成分，在图中标记为第19号峰。

XLJDD减轻结直肠癌肝转移小鼠模型的肝脏转移负荷

研究首先在CT26脾内注射建立的结直肠癌肝转移小鼠模型中评价XLJDD的抗转移作用。经过3周处理后，模型组小鼠肝脏可见大量转移结节，而XLJDD处理明显降低肝脏转移负荷，尤其是高剂量组效果更明显。定量结果显示，XLJDD可降低肝指数和肝表面可见转移结节数量，且高剂量组作用更强。体重监测未发现XLJDD处理组在实验期间出现明显毒性表现。

组织学分析进一步支持上述结果。H&E染色显示，模型组出现明显肿瘤浸润和肝组织结构破坏，而XLJDD处理减少了转移病灶，并更好地保留了肝脏结构。Cleaved caspase-3免疫组化结果提示，与未处理模型组相比，XLJDD处理后转移病灶中的凋亡信号增加，阳性面积定量结果也证实了这一变化。总体而言，这些结果表明XLJDD可在体内减轻肝转移负荷，并为后续机制研究提供依据。

图2：XLJDD减轻CT26小鼠结直肠癌肝转移模型中的肝脏转移负荷。（A）研究设计、动物模型、药物处理以及转录组/蛋白组和单细胞分析流程示意图。（B）不同组别小鼠含转移结节肝脏的大体图像。（C）实验期间体重变化曲线。（D）肝指数（%）定量。（E）肝表面可见转移结节数量定量。（F）肝转移灶代表性H&E染色图像。上方低倍图中的黑色方框标示下方放大区域，比例尺 = 1000 μm。（G）肝转移病灶中cleaved caspase-3免疫组化染色代表性图像。（H）cleaved caspase-3阳性面积（%）定量。IHC评分采用ImageJ计算。Normal，正常对照组；Model，CT26肝转移模型组；XLJDD-L，XLJDD低剂量组；XLJDD-H，XLJDD高剂量组；5-FU，氟尿嘧啶阳性对照组。数据以均值 ± 标准差表示。ns，无显著性差异；*P < 0.05，**P < 0.01。

转录组与蛋白组整合分析提示Plaur/Hbegf轴是XLJDD的候选作用靶点

为阐明XLJDD的作用机制，研究人员对肝转移组织进行了配对转录组和蛋白组分析。结果显示，XLJDD在RNA和蛋白水平均诱导了广泛分子变化。对下调特征进行通路富集分析发现，转录组层面的变化主要与受体酪氨酸激酶和MAPK相关信号通路有关；蛋白组下调特征则富集于转录调控、DNA损伤/修复和ERBB信号相关通路。

进一步整合转录组和蛋白组数据后，研究发现Hbegf等分子在XLJDD处理后出现共同下调，而Plaur在后续整合分析中被提示为与Hbegf密切相关的候选靶点。相关性分析显示Plaur与Hbegf表达呈强正相关，蛋白互作网络也支持二者之间存在紧密功能联系。qRT-PCR和Western blot验证进一步表明，XLJDD可在体内降低Plaur和Hbegf的mRNA及蛋白表达。

随后，研究人员利用公共结直肠癌数据集评价PLAUR的临床相关性。GEPIA2分析显示，与正常组织相比，PLAUR mRNA在结直肠肿瘤中表达更高。TNMplot分析进一步显示，与原发肿瘤和正常组织相比，PLAUR在转移样本中表达升高。Kaplan–Meier生存分析显示，PLAUR高表达与结直肠癌患者较差总生存相关。这些结果共同支持Plaur可能是XLJDD在CRLM中发挥作用的临床相关候选靶点。

图3：转录组与蛋白组整合分析及公共数据集验证支持Plaur/Hbegf轴是XLJDD的候选治疗靶点。（A）XLJDD处理组与模型组之间转录组分析鉴定出的差异表达基因火山图。差异表达基因定义为q值 < 0.05且|log₂倍数变化| > 1。（B）XLJDD处理组与模型组之间蛋白组分析鉴定出的差异表达蛋白火山图。差异表达蛋白采用相同阈值定义。（C）韦恩图显示模型组上调特征与XLJDD处理后下调特征之间的重叠；重叠靶点包括Hbegf、Prdx2、Dpep2和Msln。（D）Pearson相关性分析显示Plaur与Hbegf表达呈正相关。（E）蛋白–蛋白互作网络显示Plaur、Hbegf、Egfr、Mmp9、Mmp2、Adam17及相关分子之间的功能关联。（F）qRT-PCR验证不同组肝转移组织中Plaur和Hbegf mRNA水平。（G）Western blot代表性图像显示肝转移组织中Plaur和Hbegf蛋白表达。（H，I）Plaur和Hbegf蛋白表达的灰度定量，并以β-actin进行归一化。（J）GEPIA2箱线图显示，与正常组织相比，结肠腺癌（COAD）和直肠腺癌（READ）中PLAUR表达情况。（K）TNMplot箱线图显示正常组织、原发肿瘤和转移性结直肠样本中PLAUR表达情况。（L）Kaplan–Meier Plotter总生存曲线显示PLAUR高表达与结直肠癌不良预后之间的关联。适用时，数据以单个数值及均值 ± 标准差表示。统计学显著性采用单因素方差分析并进行Tukey多重比较检验。*P < 0.05，**P < 0.01。

单细胞RNA测序揭示XLJDD减少Plaur高表达恶性细胞亚群并促进干扰素反应状态

为明确XLJDD的细胞作用对象，并在单细胞分辨率下解析肿瘤微环境变化，研究人员对肝转移灶中分离出的活细胞进行了scRNA-seq分析。质量控制后，无监督聚类和UMAP可视化识别出肿瘤细胞、髓系细胞、内皮细胞、T/NK细胞、浆细胞、成纤维细胞和肝细胞等主要细胞群。经典标志基因支持这些细胞注释。进一步对恶性上皮细胞区室进行再聚类显示，恶性细胞具有明显异质性，标志基因支持不同恶性细胞亚群的注释。

随后，研究采用MiloR差异丰度分析评估XLJDD处理相关的恶性细胞状态变化。结果显示，XLJDD引起恶性细胞邻域的广泛重塑；亚群水平分析显示，Car6+恶性细胞亚群减少，而Ifit1+亚群增加。Plaur表达尤其富集于Car6+恶性细胞亚群。拟时序分析进一步提示细胞轨迹趋向终末Car6+状态，而XLJDD处理与向Ifit1+状态偏移相关。

单细胞代谢通路评分显示，XLJDD处理后恶性细胞功能程序发生改变，包括脂肪酸、丙酮酸、花生四烯酸、鞘脂以及谷氨酸/谷氨酰胺代谢等。通路评分进一步提示，XLJDD处理后恶性细胞发生广泛功能重编程，涉及代谢、蛋白稳态以及抗原呈递相关通路。转录因子分析显示，XLJDD处理组中Stat1、Irf1、Irf7等干扰素相关调控子活性增强，提示其与I型干扰素反应状态一致。总体来看，XLJDD可减少Plaur高表达恶性细胞状态，并促进肿瘤向更具干扰素反应性的表型转变。

图4：scRNA-seq揭示XLJDD处理后恶性上皮细胞异质性及治疗相关细胞状态转换。（A）UMAP图显示肿瘤细胞再聚类后识别出的恶性上皮细胞亚群。（B）投影到UMAP上的差异邻域丰度分析，显示对照组与药物处理组之间恶性细胞状态的治疗相关变化。（C）恶性上皮细胞亚群中邻域log倍数变化分布，突出XLJDD处理后的亚群特异性变化。（D）小提琴图显示Plaur在恶性上皮细胞各亚群中的表达。（E）恶性上皮细胞拟时序轨迹分析，左图按细胞亚群着色，右图按拟时序着色。（F）热图显示恶性上皮细胞中单细胞代谢通路活性的治疗相关变化。（G）热图显示对照组与药物处理组恶性上皮细胞之间差异富集通路。（H）转录因子/调控子活性分析显示对照组与药物处理组之间差异调控子活性；下方图显示每组中排序后的调控子重要性。Control，模型组；Drug，XLJDD处理组；logFC，log倍数变化；UMAP，统一流形近似与投影。

XLJDD削弱Plaur高表达恶性细胞与肿瘤相关巨噬细胞之间的促转移通讯

鉴于XLJDD明显改变了肿瘤微环境，研究进一步分析了scRNA-seq数据中的髓系细胞区室。UMAP分析在肝转移生态位中识别出多个髓系细胞亚群，其中包括一个明确的Thbs1+肿瘤相关巨噬细胞（TAM）亚群。差异丰度分析显示，XLJDD处理后髓系细胞状态发生广泛重塑；亚群变化提示Thbs1+ TAM群体在处理后减少。Plaur表达在Thbs1+ TAM亚群中相对富集。拟时序分析进一步提示髓系细胞轨迹趋向终末Thbs1+ TAM状态，而XLJDD处理与远离该状态相关。

单细胞通路和调控子分析进一步显示，XLJDD处理引起髓系细胞重编程，包括花生四烯酸、类固醇、糖鞘脂和鞘脂代谢变化，以及氧化磷酸化相关通路和干扰素相关转录程序改变。CellChat分析显示，SPP1为中心的信号在转移生态位中较为突出，并在XLJDD处理后减弱。聚焦Car6+恶性细胞与Thbs1+ TAM之间互作后，研究发现显著的Spp1-Cd44互作在XLJDD处理后被削弱。进一步的Plaur过表达实验显示，Plaur过表达可增加CT26细胞中Spp1 mRNA表达及培养上清中分泌型SPP1水平。在CT26–RAW264.7共培养体系中，与Plaur过表达CT26细胞共培养的巨噬细胞表现出CD44、Arg1和Mrc1蛋白表达增加。这些结果支持Spp1-Cd44相关巨噬细胞程序至少部分与肿瘤细胞Plaur活性有关。

图5：scRNA-seq揭示XLJDD处理后髓系细胞状态重塑以及Car6+恶性细胞与Thbs1+ TAM之间通讯改变。（A）UMAP图显示肝转移组织中识别出的髓系细胞亚群。（B）投影到UMAP上的差异邻域丰度分析，显示对照组与药物处理组之间髓系细胞状态的治疗相关变化。（C）髓系细胞亚群中邻域log倍数变化分布，突出XLJDD处理后的亚群特异性变化。（D）小提琴图显示Plaur在髓系细胞各亚群中的表达。（E）髓系细胞拟时序轨迹分析，左图按细胞亚群着色，右图按拟时序着色。（F）热图显示髓系细胞中单细胞代谢通路活性的治疗相关变化。（G）转录因子/调控子活性分析显示对照组与药物处理组之间差异调控子活性；下方图显示每组中排序后的调控子重要性。（H）点图显示对照组和药物处理组中以Car6+恶性细胞与Thbs1+ TAM为中心的选定配体–受体互作。Control，模型组；Drug，XLJDD处理组；TAMs，肿瘤相关巨噬细胞；Comm. Prob.，通讯概率；UMAP，统一流形近似与投影。

Plaur敲低抑制CT26细胞迁移、侵袭和肌动蛋白骨架重塑

为研究Plaur在结直肠癌细胞中的作用，研究人员构建了稳定敲低或过表达Plaur的CT26细胞系，并通过qRT-PCR和Western blot确认转染效率。在划痕实验中，与匹配对照细胞相比，Plaur敲低显著减缓划痕闭合。Transwell实验也显示，Plaur敲低明显降低CT26细胞侵袭能力。

为探索Plaur与细胞骨架重塑之间的下游机制，研究人员对Plaur敲低和对照CT26细胞进行了转录组测序，并将Plaur敲低后下调基因与XLJDD体内处理后下调基因取交集，获得131个共同下调基因。对这些重叠基因进行通路富集分析发现，相关通路集中于RHO家族GTP酶信号，包括RHOA、RHOB、RAC1 GTP酶循环相关过程，提示Plaur在功能上与肌动蛋白骨架动态变化和丝状伪足形成有关。qRT-PCR进一步验证了Arhgef25、Cdc42ep1、Fscn1和Hbegf等Plaur相关下游基因的变化。

由于细胞迁移依赖肌动蛋白骨架重塑和丝状伪足形成，研究进一步采用鬼笔环肽染色并通过共聚焦显微镜观察细胞形态。Plaur敲低细胞表现出较弱的极性形态和较少的丝状伪足，丝状伪足密度定量也证实了这一变化。此外，公共结直肠癌数据集分析显示，人结直肠癌组织中PLAUR与FSCN1 mRNA表达呈正相关。以上结果支持Plaur通过调控肌动蛋白骨架重塑促进转移相关行为。

图6：Plaur敲低削弱CT26细胞迁移、侵袭和肌动蛋白骨架重塑。（A）对照（NC）和Plaur敲低（KD）CT26细胞在0、12、24和48 h的代表性划痕实验图像。（B）NC和KD细胞在指定时间点的划痕闭合定量。（C）NC和KD细胞Transwell侵袭实验代表性图像。（D）Transwell实验中侵袭细胞定量。（E）韦恩图显示Plaur敲低CT26细胞中下调基因与XLJDD体内处理后下调基因之间的重叠，共鉴定出131个共同下调基因。（F）131个共同下调基因的通路富集分析，突出RHO家族GTP酶信号相关通路。（G）qRT-PCR验证与Plaur相关的选定下游基因，包括Arhgef25、Cdc42ep1、Fscn1和Hbegf。（H）鬼笔环肽染色F-actin和DAPI染色细胞核的代表性共聚焦图像，NC和KD细胞中放大视图显示丝状伪足。（I）基于鬼笔环肽染色图像定量丝状伪足密度。（J）公共结直肠癌数据集中PLAUR与FSCN1表达正相关分析。数据来自三次独立实验，以均值 ± 标准差表示。统计学显著性采用非配对Student t检验。*P < 0.05，**P < 0.01。NC，阴性对照；KD，Plaur敲低细胞；DAPI，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚。

XLJDD抑制Plaur相关Mmp9/Hbegf信号、EGFR/ERK激活及细胞骨架效应分子

鉴于Plaur与细胞周围蛋白水解和生长因子释放相关，研究首先考察Plaur是否影响CT26细胞中Mmp9相关的Hbegf信号。Western blot及灰度定量显示，Plaur敲低降低Mmp9蛋白表达，而Plaur过表达相对于对应阴性对照增加Mmp9表达。Hbegf蛋白水平也随Plaur操作而改变。培养上清中分泌型Hbegf水平呈现Plaur相关趋势，即过表达条件下高于敲低条件，尽管与相应对照的成对比较变化较为温和。这些数据提示Plaur与CT26细胞中的Mmp9/Hbegf相关信号有关，其中Mmp9显示出最一致的Plaur依赖性变化。

随后，研究检测了XLJDD处理小鼠肝转移组织中的下游信号和细胞骨架相关效应分子。qRT-PCR显示，XLJDD降低Fscn1、Arhgef25、Cdc42ep1和Rtkn的mRNA表达，且高剂量组抑制作用更强。Western blot结果与之相符，显示XLJDD降低肝转移组织中Mmp9、Cdc42ep1和Fscn1蛋白水平，并通过三次独立实验的灰度定量得到验证。XLJDD还显著降低Egfr和Erk磷酸化，表现为p-Egfr/Egfr和p-Erk/Erk比值下降。总体而言，这些数据提示XLJDD可抑制Mmp9/Hbegf相关信号、EGFR/ERK激活以及与转移行为相关的细胞骨架效应分子。

图7：Plaur相关Mmp9/Hbegf信号以及XLJDD介导的EGFR/ERK激活和细胞骨架效应分子抑制。（A）Western blot分析Plaur敲低和Plaur过表达CT26细胞及其相应阴性对照中Mmp9和Hbegf蛋白表达，GAPDH作为上样对照。（B，C）Mmp9和Hbegf蛋白表达的灰度定量，并以GAPDH归一化。KD与NC1比较，OE与NC2比较。（D）NC1、KD、NC2和OE CT26细胞培养上清中的分泌型Hbegf水平。（E）qRT-PCR分析指定组肝转移组织中Fscn1、Arhgef25、Cdc42ep1和Rtkn mRNA表达。（F，G）Western blot分析肝转移组织中Mmp9和Cdc42ep1蛋白表达及灰度定量，β-actin作为上样对照。（H，I）Western blot分析肝转移组织中Fscn1蛋白表达及灰度定量，GAPDH作为上样对照。（J，K）Western blot分析Egfr和p-Egfr，并定量p-Egfr/Egfr比值。（L，M）Western blot分析Erk和p-Erk，并定量p-Erk/Erk比值。图中显示三次独立实验的代表性Western blot图像。数据以单个数值及均值 ± 标准差表示。KD与NC1、OE与NC2之间的预设比较采用非配对Student t检验；多组组织比较采用单因素方差分析并进行Tukey多重比较检验。ns，无显著性差异；*P < 0.05，**P < 0.01。

Plaur过表达削弱XLJDD在体内的抗转移作用

为判断XLJDD的抗转移效应是否依赖Plaur抑制，研究人员采用对照CT26细胞（NC）或Plaur过表达CT26细胞（Plaur-OE）进行体内救援实验。大体观察显示，在NC背景下，XLJDD显著降低肝脏转移负荷；但Plaur过表达明显削弱这一作用。与NC+XLJDD组相比，OE+XLJDD组仍出现广泛肝转移，肿瘤负荷显著增加。定量分析进一步显示，Plaur过表达逆转了XLJDD引起的肝指数下降和肝表面可见转移结节减少。体重曲线显示，实验期间未观察到明显体重下降。

在分子层面，肝转移组织qRT-PCR结果显示，即使接受XLJDD处理，Plaur过表达仍增加Plaur表达，并部分恢复Hbegf、Fscn1和Cdc42ep1表达。组织学分析显示，NC+XLJDD组中XLJDD限制了转移生长并保护肝组织结构，而OE+XLJDD组显示更广泛的肿瘤浸润和组织破坏。Ki67免疫组化进一步显示，Plaur过表达抵消了XLJDD的抗增殖作用。同时，Plaur免疫组化证实，过表达组肿瘤组织中Plaur表达在XLJDD处理下仍然维持；FSCN1染色则显示，Plaur过表达削弱了XLJDD对这一细胞骨架相关效应分子的抑制。上述救援实验支持Plaur是介导XLJDD抗CRLM作用的关键功能靶点。

图8：Plaur过表达削弱XLJDD在体内的抗转移作用。（A）注射对照CT26细胞（NC）或Plaur过表达CT26细胞（Plaur-OE）并接受或未接受XLJDD处理的小鼠肝脏代表性大体图像。（B）指定组肝指数定量。（C）指定组肝表面可见转移结节数量定量。（D）qRT-PCR分析指定组肝转移组织中Plaur、Hbegf、Fscn1和Cdc42ep1 mRNA表达。（E）肝转移病灶代表性H&E染色图像。上方面板中的黑色方框表示下方面板放大区域。（F）肝转移组织中Ki67免疫组化代表性染色。（G）肝转移组织中Plaur免疫组化代表性染色。（H）肝转移组织中FSCN1免疫组化代表性染色。（I）Ki67阳性面积定量。（J）Plaur阳性面积定量。（K）FSCN1阳性面积定量。B–D和I–K图中的数据以单个数值及均值 ± 标准差表示。统计学显著性采用单因素方差分析并进行Tukey多重比较检验。ns，无显著性差异；*P < 0.05，**P < 0.01。NC，对照CT26组；NC+XLJDD，XLJDD处理的对照CT26组；Plaur-OE，Plaur过表达CT26组；OE+XLJDD，XLJDD处理的Plaur过表达CT26组；H&E，苏木精-伊红染色。

Cyclogalegenin是可进入肝转移组织并结合Plaur的XLJDD来源成分

为识别可能参与Plaur靶向的活性成分，研究人员通过UPLC-MS/MS分析了生物样本中的XLJDD来源化合物。在小鼠血清和肝转移组织中检测到多种吸收成分，代表性色谱图显示cyclogalegenin存在于两个样本区室。化学超类分析显示，这些吸收成分属于多种化学类别，其中萜类以及类固醇/类固醇衍生物占比较高。来源追踪进一步提示，检测到的吸收成分来源于XLJDD中多味组成药材。与此同时，对apigenin、astragenol、cyclogalegenin、naringenin和sophoridine等代表性吸收候选成分进行分子对接分析，支持多种XLJDD来源成分具有与Plaur互作的潜力。基于组织可及性和预测的Plaur结合能力，作者选择cyclogalegenin进行进一步验证。

Cyclogalegenin的化学结构被展示后，分子对接预测其可在Plaur结合口袋内形成稳定结合构象，并与ARG-48、GLU-91、THR-50、ASP-275、SER-276、TRP-267、HIS-187和LEU-189等周围残基发生相互作用。为进一步判断cyclogalegenin能否在细胞水平调控Plaur表达，研究人员使用不同浓度cyclogalegenin处理CT26细胞。qRT-PCR显示，cyclogalegenin处理12 h后可降低Plaur mRNA表达；Western blot进一步证实，处理24 h后Plaur蛋白表达呈浓度依赖性下降。这些结果提示，cyclogalegenin不仅被预测可结合Plaur，还能抑制CT26细胞中Plaur表达。

为定量口服XLJDD后靶组织中的成分暴露，研究进一步采用靶向UHPLC-MRM-MS/MS检测肝转移组织中cyclogalegenin含量。结果显示，在3份XLJDD处理小鼠肝转移组织样本中均可定量检测到cyclogalegenin，浓度分别为504.31、1026.37和484.10 ng/g组织，平均浓度为671.59 ± 307.41 ng/g组织。Cyclogalegenin标准品和肝转移组织样本的代表性提取离子色谱图显示一致的保留时间，约为7.35–7.37 min，支持靶向定量结果的可靠性。这些数据证实，口服XLJDD后cyclogalegenin可到达肝转移组织。

最后，研究采用生物物理实验验证cyclogalegenin与Plaur之间的直接结合。SPR分析显示，cyclogalegenin与重组Plaur呈浓度依赖性结合。MST进一步确认了这种相互作用，并得到解离常数Kd为36.74 ± 3.34 μM。除cyclogalegenin外，补充分子对接和生物物理分析还显示naringenin也可与Plaur互作，MST测得Kd为7.32 ± 0.81 μM。总体而言，这些结果鉴定出cyclogalegenin是XLJDD中一种可进入组织并结合Plaur的成分，并提示多种吸收成分可能共同参与Plaur中心通路调控。

图9：Cyclogalegenin是一种可进入组织并结合Plaur、同时抑制Plaur表达的成分。（A）代表性色谱图显示XLJDD给药后小鼠血清中检测到的吸收成分。（B）代表性色谱图显示XLJDD处理后肝转移组织中检测到的成分。（C）饼图显示生物样本中检测到的吸收成分化学超类分布。（D）柱状图显示检测到的吸收成分在XLJDD组成药材中的来源分布。（E）Cyclogalegenin化学结构。（F）Cyclogalegenin在Plaur结合口袋中的预测对接构象。（G）qRT-PCR分析CT26细胞经0、5、10和20 μM cyclogalegenin处理12 h后Plaur mRNA表达。（H）代表性Western blot图像显示CT26细胞经cyclogalegenin处理24 h后Plaur蛋白表达。（I）Plaur蛋白表达灰度定量，并以GAPDH归一化。（J）靶向UHPLC-MRM-MS/MS定量口服XLJDD后肝转移组织中的cyclogalegenin。数据以单个数值及均值表示。（K）代表性SPR传感图显示cyclogalegenin与重组Plaur的浓度依赖性结合。（L）Cyclogalegenin与Plaur结合的MST曲线，显示解离常数（Kd）为36.74 ± 3.34 μM。适用时，数据以单个数值及均值 ± 标准差表示。SPR，表面等离子共振；MST，微量热泳动；Kd，解离常数；RU，响应单位；Fnorm，归一化荧光。在D图中，缩写表示仙连解毒方对应组成药材：HQ，黄芪；BZ，白术；SL，三棱；EZ，莪术；YYR，薏苡仁；KS，苦参；XHC，仙鹤草。

Plaur中心机制示意图总结XLJDD的抗转移作用

基于上述结果，作者提出了以Plaur为中心的XLJDD抗结直肠癌肝转移机制。在促转移状态下，结直肠癌细胞中Plaur高表达，并与Mmp9共同促进Hbegf释放；分泌型Hbegf进一步结合Egfr并激活Erk磷酸化，进而促进Fscn1和Cdc42ep1表达，增强肌动蛋白骨架重塑和丝状伪足形成，最终支持侵袭与转移。XLJDD及其活性成分cyclogalegenin可抑制Plaur，从而阻断Mmp9介导的Hbegf释放，抑制Egfr/Erk信号，降低Fscn1和Cdc42ep1表达，干扰丝状伪足形成，并限制肝转移。

图10：XLJDD在结直肠癌肝转移中发挥抗转移作用的Plaur中心信号机制示意图。左侧面板（促转移状态）：在结直肠癌细胞中，Plaur高表达与Mmp9共同促进Hbegf（sHbegf）剪切释放。分泌型Hbegf随后结合Egfr并激活Erk磷酸化。该通路增加Fscn1和Cdc42ep1表达，促进肌动蛋白骨架重塑和丝状伪足形成，并支持侵袭和转移。右侧面板（抗转移状态）：XLJDD及其活性化合物cyclogalegenin抑制Plaur。这一作用阻断Mmp9介导的Hbegf剪切释放，抑制Egfr/Erk信号，降低Fscn1和Cdc42ep1表达，破坏丝状伪足形成，并限制肝转移。

【贡献】★★★★★

本研究表明，仙连解毒方可通过以Plaur为中心的机制抑制结直肠癌肝转移。XLJDD能够抑制Plaur相关信号，限制肿瘤细胞中的肌动蛋白骨架重塑，并削弱恶性细胞与肿瘤相关巨噬细胞之间Spp1-Cd44介导的通讯。结合cyclogalegenin作为一种可进入组织并结合Plaur的成分被鉴定出来，这些发现为进一步开展XLJDD在CRLM中的临床前评价提供了机制和药理学依据。

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