中国农业大学：GRP78作为通过网格蛋白介导的内吞作用促进人畜共患猪三角洲冠状病毒内化和复制的新型宿主因子的鉴定

I论文导读

猪丁型冠状病毒（PDCoV）是一种具有跨物种传播能力和大流行潜力的新发人兽共患病原体，2021年在海地三名急性发热患儿体内的发现，使其公共卫生意义骤然提升。然而，当前对PDCoV入侵机制的认识仍十分有限。已知的受体猪氨基肽酶N（pAPN）在敲除后并不能完全阻断病毒感染，提示存在其他重要的宿主因子参与病毒侵入过程。

2025年7月6日，中国农业大学研究团队在Journal of Virology上发表题为“Identification of GRP78 as a novel host factor that facilitates zoonotic porcine deltacoronavirus internalization and replication via clathrin-mediated endocytosis”的最新研究论文。本研究揭示了PDCoV-宿主相互作用的新机制，该机制以GRP 78介导的病毒附着和通过网格蛋白依赖性内吞作用的内化为中心。

IF：4.1 中科院1区 | JCR/Q2 病毒学

参考译文： GRP78作为通过网格蛋白介导的内吞作用促进人畜共患猪三角洲冠状病毒内化和复制的新型宿主因子的鉴定

第一作者：Xinrong Zhou

通讯作者：Deyin Guo, Hanchun Yang

I主要研究结果

1.拯救具有S1/S2和S2 ′切割位点突变的重组病毒为鉴定PDCoV S1蛋白互作的膜蛋白，研究者利用Co-IP联合LC-MS/MS，从猪肠上皮细胞（IPEC-J2）中筛选出19个显著富集的候选分子，并选取其中4个进行功能验证。通过特异性siRNA敲低各靶基因，发现pAPN、GRP78、HSPG2和CD109的沉默均显著降低PDCoV滴度，提示这些蛋白均参与病毒感染。进一步在非易感BHK-21细胞中分别过表达上述蛋白，结果显示pAPN和GRP78过表达能显著增强PDCoV的感染水平（经IFA、RT-qPCR和TCID₅₀验证），CD109也有一定促进但效果较弱，而HSPG2未获有效表达。

图1. 宿主因子pAPN、GRP78、HSPG2和CD109参与PDCoV感染

2.GRP78对PDCoV附着和内化至关重要

研究者通过多种策略系统验证了GRP78在PDCoV吸附和内化中的关键作用。首先，抗体阻断实验显示，抗GRP78抗体单独处理即可显著抑制IPEC‑J2细胞的PDCoV感染，与抗pAPN抗体联用则呈现叠加效应，提示二者功能互补。RNAscope原位杂交及膜结合病毒定量分析进一步证实，阻断GRP78可显著减少病毒颗粒在细胞表面的吸附量。为排除pAPN干扰，研究者构建了pAPN/HSPG2双基因敲除细胞，在此背景下再施加抗GRP78抗体阻断，仍能显著降低PDCoV滴度和N蛋白表达，明确GRP78以pAPN非依赖方式参与病毒进入。病毒内化动力学实验表明，GRP78敲低或抗体阻断后，内化的病毒RNA水平在1～2小时内显著减少，且GRP78特异性抑制剂HA15和可溶性GRP78-Fc蛋白均能有效抑制内化。

图2.阻断GRP78使PDCoV细胞附着和进入

图3.抗体封闭pAPN/HSPG 2双基因敲除细胞表面GRP 78抑制PDCoV感染

3.GRP78蛋白通过SBD结构域与PDCoV S1相互作用

研究者进一步验证了GRP78与PDCoV S1蛋白的直接互作及其结合结构域。高分辨共聚焦显微镜显示，在PDCoV感染的IPEC‑J2细胞中，无论是否透化处理，GRP78与S1均在细胞表面和质膜区域显著共定位。Co‑IP实验表明，纯化的GRP78‑Fc能特异性结合S1‑His，反之S1‑Fc亦可捕获GRP78‑His，而阴性对照N蛋白均无结合，排除了非特异性干扰。表面等离子体共振（SPR）和生物层干涉（BLI）测定显示，GRP78与S1的平衡解离常数（KD）分别为17.3 μM和11.5 μM，均显著低于pAPN与S1的亲和力（73.1 μM和41.3 μM），提示GRP78对S1具有更强结合能力。为定位互作结构域，研究者将GRP78分为NBD、SBD和V三个结构域，S1分为NTD和CTD，分别共转染BHK‑21细胞。免疫荧光共定位显示仅SBD与CTD存在明显重叠，Co‑IP进一步验证二者可相互沉淀。

图4.GRP78蛋白通过SBD结构域与PDCoV S1蛋白相互作用

4.GRP78以物种和组织独立的方式促进PDCoV内化

为验证GRP78促进PDCoV内化的功能是否具有广谱性，研究者选取了不同物种和组织来源的多种细胞系及猪原代小肠上皮细胞进行验证。在猪源细胞系（IPEC‑J2、LLC‑PK1、PK‑15、ST）中过表达GRP78后，PDCoV内化效率提高了2.1～2.8倍；在人源细胞系（Huh‑7、Caco‑2、HEK293T）中提高1.5～2.2倍；在非人灵长类VeroE6细胞中亦提高1.3～1.6倍，表明该功能不局限于猪源细胞。

在猪原代小肠上皮细胞中，研究者采用了三种正交策略。siRNA敲低GRP78（效率＞90%）后，病毒内化（2 h）、复制（12 h）和释放（24 h）各时间点的滴度均显著下降，与IPEC‑J2结果一致。抗GRP78抗体阻断呈剂量依赖性地抑制病毒吸附和内化，可溶性GRP78‑Fc蛋白竞争亦产生相同效果。以上结果在更接近生理状态的原代细胞模型中确证了GRP78的功能。

图5.GRP 78介导多种细胞系和原代猪肠上皮细胞中的PDCoV感染

5.GRP78主要通过网格蛋白介导的内吞作用和pAPN非依赖性途径介导PDCoV细胞进入

明确GRP78介导PDCoV进入的具体内吞途径及与pAPN的关系，研究者使用特异性内吞抑制剂进行通路鉴定。结果显示，网格蛋白抑制剂Pitstop 2和Dynasore能显著降低PDCoV滴度，而巨胞饮抑制剂EIPA和Cytochalasin D仅产生轻微抑制效果，表明网格蛋白介导的内吞是PDCoV进入的主要途径，巨胞饮仅起次要作用。上述抑制剂浓度对细胞活力无影响，且阳性对照PEDV同样受抑制，排除脱靶效应。

在通路关联方面，Co-IP实验证实GRP78与网格蛋白存在组成性相互作用，但与pAPN无互作。进一步构建GRP78Δ193-225aa突变体（破坏与网格蛋白的结合），该突变体无法有效结合网格蛋白，转染后PDCoV感染滴度显著低于野生型GRP78组，证明GRP78-网格蛋白偶联对病毒进入具有功能重要性。

图6.GRP78主要通过网格蛋白介导的内吞途径介导PDCoV细胞进入

6.GRP78蛋白促进其他冠状病毒感染

为探究GRP78促进病毒进入的功能是否泛化于其他冠状病毒，研究者选取了7种代表性病毒（PEDV、SADS‑CoV、TGEV、MHV‑A59、HCoV‑229E、HCoV‑NL63及SARS‑CoV‑2），分别在其易感细胞中施加GRP78干预。首先采用GRP78特异性小分子抑制剂HA15处理细胞，结果显示PEDV、TGEV和SARS‑CoV‑2的进入效率显著降低50%～70%，而SADS‑CoV、MHV、HCoV‑229E和HCoV‑NL63的抑制率不足20%，无统计学意义，提示不同病毒对GRP78的依赖程度存在差异。

为进一步确证，研究者采用siRNA敲低和抗体阻断两种正交策略，获得一致结果：GRP78沉默或抗体封闭后，PEDV、TGEV和SARS‑CoV‑2的内化滴度显著下降，而其余4种病毒无明显变化。三种不同方法的交叉验证增强了结论的可靠性。

图7.GRP78蛋白促进其他冠状病毒的感染

研究总结

本研究通过Co-IP联合LC-MS/MS，从猪肠上皮细胞中系统性筛选并验证了GRP78、HSPG2和CD109等多个参与PDCoV感染的膜蛋白，其中首次鉴定了GRP78作为PDCoV进入的关键宿主因子。GRP78通过其SBD结构域直接结合PDCoV S1蛋白的CTD结构域（亲和力KD约11.5～17.3 μM，优于经典受体pAPN），在病毒吸附和内化阶段发挥重要作用。机制上，GRP78不依赖pAPN，而是通过与网格蛋白组成性互作，在病毒结合后增强该互作，将病毒-受体复合物偶联至网格蛋白内吞机器，以网格蛋白介导的内吞为主要途径实现高效进入，巨胞饮仅起次要作用。这一发现揭示了GRP78作为"进入辅助因子"协同pAPN促进病毒内化的新机制。

值得注意的是，GRP78促进PDCoV内化的功能在多物种（猪、人、猴）、多组织来源细胞系及猪原代肠上皮细胞中均得到验证，展现出高度的物种和组织广谱性。此外，GRP78同样可促进PEDV、TGEV和SARS-CoV-2等其他冠状病毒的进入（抑制率50%～70%），但对SADS-CoV、MHV及HCoV-229E/NL63效果不显著，提示不同冠状病毒对GRP78的依赖性存在差异。这一差异性可能与S蛋白结构差异或替代受体使用有关，为理解冠状病毒入侵策略的多样性提供了新视角，也为靶向GRP78的广谱抗病毒策略界定了适用范围。

源论文链接：https://journals.asm.org/journal/jvi on 13 July 2026 by 58.58.135.38.

编辑：九九

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