磷酸化 WB 难做？这篇 Nature 干脆放弃了 β-actin/GAPDH

神经科学临床转化价值高，也是高分论文产出的热门领域，但脑组织样本本身的特性，给 WB 实验带来重重阻碍，很多实验室都面临共性难题：

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脑组织样本十分稀缺：脑组织分区取材操作复杂、周期长，反复冻融还容易发生蛋白降解，每一份样本都不敢浪费。

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磷酸化靶标多，传统 WB 通量捉襟见肘：研究信号通路，既要测磷酸化蛋白，还要检测对应总蛋白、胶质标记、激酶等多个指标。传统方案需要反复切膜、跑多张胶，一张膜仅能检测 1～2 个靶标，珍贵样本很快消耗殆尽。切膜还会带来膜与膜之间的系统误差，干扰磷酸化 / 总蛋白比值的真实判断。

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内参本身也可能「失真」：当研究聚焦神经炎症、能量代谢紊乱这类脑区特异性分子改变时，GAPDH、β-actin 这类管家蛋白本身就会随病理状态发生表达漂移。

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顶刊数据要求高，重复率难保证：现在 Nature、Cell 子刊等顶级期刊，对 WB 原始条带、上样质控证据、溯源原图都有明确要求。

最近一篇发表于 Nature 的自闭症重磅研究「An X-linked long non-coding RNA, PTCHD1-AS, and the core features of autism」[1]，为应对这些问题提供了值得借鉴的实验思路。点击此处申请免费试用

从 Nature 自闭症研究，看懂总蛋白归一化的真实价值

这篇研究围绕 X 连锁长非编码 RNA PTCHD1-AS 开展，该基因是自闭症风险基因，敲除该基因的雄性小鼠会表现出社交缺陷、重复刻板行为等自闭症核心表型，但不伴随严重认知损伤。课题组大量使用小鼠纹状体、皮层分区脑组织开展多组学与蛋白验证，需要检测PKCα 总蛋白、p-Src、p-GluN2A、p-GSK-3α/β等一系列磷酸化与总蛋白，样本资源十分有限。

图 1 纹状体组织 WB 定量统计结果

研究发现：Ptchd1-as 敲除小鼠分子改变具备严格脑区特异性：仅纹状体出现 cPKC 家族总蛋白下调，Src、GSK-3α/β 通路磷酸化水平显著升高，皮层无上述改变；同时纹状体出现轻度反应性胶质增生，GFAP 上调，糖酵解、氧化磷酸化通路发生明显扰动。

这恰恰就是传统管家蛋白的「雷区场景」：神经炎症激活、糖酵解与氧化磷酸化紊乱，GAPDH、β-actin 表达水平会随之改变。如果采用传统单一内参校正，很可能混淆「管家蛋白自身变化」和「目的蛋白真实改变」，无法精准区分纹状体特异性病变。

为规避这个风险，整篇研究的 WB 实验全部采用Bio-Rad Stain-Free 全泳道免染总蛋白归一化策略，同时搭配多重荧光 Western Blot，在单张膜完成多个蛋白连续检测，把有限的脑组织样本价值最大化。

图 2 WB 完整原始图像，中间图为用于泳道间上样量归一化的 Stain-Free 免染总蛋白染色信号

实验流程中，电泳结束后直接对凝胶做 UV 激活，获取每一个泳道全部总蛋白信号，转膜之后膜上总蛋白图像可留存归档，再孵育不同荧光二抗，一张膜上同时读取 PKCα、Src、GluN2A、GSK-3α/β、GFAP、FMRP 等多个靶蛋白，区分总蛋白基准，实现蛋白定量校正。

图 3 同一批 WT/KO 小鼠，纹状体和皮层平行检测对比

依靠这套方案，研究团队精准捕捉到敲除小鼠纹状体 cPKC 家族蛋白下调、Src 与 GSK-3 通路磷酸化水平上升，并且证实上述分子改变只发生在纹状体，皮层组织无明显变化，完美匹配转录组、蛋白质组多组学结论。

Stain-Free 免染总蛋白完整方案，复刻高分实验

其实总蛋白归一化，简单理解就是不以某一个蛋白做标尺，而是以该泳道所有蛋白总信号作为上样参照，不受单个蛋白病理条件下表达波动干扰。Bio-Rad Stain-Free 免染总蛋白整套方案，针对性解决脑组织研究两大核心痛点：

1. 全泳道总蛋白归一化，破解管家蛋白失真难题

不再完全依赖 GAPDH、β-actin 等单一管家蛋白。Stain-Free 技术标记凝胶内全部蛋白，每个泳道获得独立总蛋白信号，直接校正泳道上样量差异。即便发生神经炎症、能量代谢通路改变，总蛋白信号不会随单一蛋白表达漂移，提供更加客观、稳健的定量基准，尤其适配脑区分区对比、神经疾病模型样本。

2. 完整膜图留存溯源，契合高分期刊发表规范，支撑多组学交叉验证

Stain-Free 获取的完整凝胶、膜上总蛋白原始图像可以完整保存。现在 Nature 等期刊越来越要求提交 WB 完整原始图片，总蛋白染色结果可以直接作为上样质控证据，应对审稿人质疑。同时，稳定可靠的 WB 蛋白定量结果，可以和转录组、蛋白质组数据相互印证，完善多组学联合研究证据链。

除此之外，这篇 Nature 还使用了多重荧光 WB 技术，实现一膜多检，节约珍贵脑组织同一张 PVDF 膜无需切膜，连续检测磷酸化靶标、对应总蛋白、其他功能蛋白。不用消耗大量分区脑组织，同时消除多胶、多膜之间的系统偏差，让磷酸化 / 总蛋白比值的计算更加可靠，这对于信号通路机制研究至关重要。

图4 总 Src 蛋白和 Tyr416 位点磷酸化 Src 的 WB 结果，同时使用 Stain-Free 总蛋白做为上样控制

传统化学发光 Western Blot 检测磷酸化蛋白通常需要先检测磷酸化形式（如 pSrc Y416），再经过剥膜（strip）后重新检测总蛋白（Total Src）和内参蛋白。这种方法操作繁琐，容易因剥膜过程导致蛋白损失、信号衰减和实验变异增加。同时，不同轮次曝光和检测条件的差异也会影响定量准确性，使磷酸化水平与总蛋白表达量之间的比较可靠性下降。相比之下，多色荧光 Western Blot 能够在同一张膜上同步检测磷酸化蛋白、总蛋白和归一化信号，从而获得更加准确、可重复的定量结果。

小结

这篇 Nature 研究带来的启示，并不是「GAPDH、β-actin 从此不能用」，而是：任何内参都不应在未经验证的情况下被默认稳定。特别是在脑组织、炎症模型和代谢通路发生改变的研究中，归一化方式本身就是实验设计的一部分。

研究团队采用 TGX Stain-Free 凝胶、ChemiDoc MP 成像、全泳道总蛋白归一化与内部批次对照，支持了纹状体与皮层、WT 与 KO 之间的可靠比较，也为神经科学 WB 实验提供了一套可参考的质量控制思路。ChemiDoc MP 与 StarBright 多色荧光 Western Blot 可一次实验同时检测 Total Protein、Phospho Protein 和 Normalization Signal，避免 Strip & Reprobe 带来的误差，实现更快速、更准确、更可重复的定量分析。

为了帮助科研人员减少因内参选择和归一化方式不当造成的重复实验，我们准备了Stain-Free 免染 WB 实验流程免费试用，如果您对多色荧光 WB 实验感兴趣，也可同时申请试用。点击下方小程序码，即可申请获取。

注：

1. 相关产品仅限科研使用，不作为临床诊断。

2. Bio-Rad 是 Bio-Rad Laboratories，Inc. 在特定区域的商标。

3. 本活动的最终解释权归伯乐生命医学产品（上海）有限公司。

内容策划：沈佳钰

内容审核：周育红

题图来源：参考文献[1]

参考文献：

[1]. Bradley CA, Ko SY, Tian M, Ralph LT, D'Abate L, et al. An X-linked long non-coding RNA, PTCHD1-AS, and the core features of autism. Nature. 2026 Jul 9;655(7842):418-428. doi: 10.1038/s41586-026-10515-6.