Exploration (IF=22.5)｜四类活性成分“既是载体也是药物”：融合细胞外囊泡协同HGF/PPC，多维修复急性肝衰竭！(张金凤/胡敏团队)

2026年7月31日，北京理工大学生命学院张金凤 教授团队联合暨南大学附属第一医院胡敏教授团队、北京清华长庚医院等单位，在Exploration (IF=30.4)在线发表题为“Quadruplex Bioactive FAND for Treating Acute Liver Failure Induced by Acetaminophen or Hepatectomy”的研究论文。张金凤教授与胡敏教授为共同通讯作者。该文于2025年7月19日投稿，2026年1月25日修回，2026年5月3日接收。Exploration官网当前显示其Impact Factor为30.4。

急性肝衰竭（acute liver failure，ALF）以大面积肝细胞坏死、肝功能急剧下降及较高死亡风险为主要特征。肝移植和人工肝支持系统虽然可用于部分患者，但仍受到供体短缺、治疗费用高和长期免疫抑制等因素限制。与此同时，传统纳米药物常存在活性药物成分装载比例低、惰性载体清除困难及单一治疗机制疗效不足等问题。

针对上述难点，研究团队基于全药物活性成分纳米药物（full-API nanodrug，FAND）理念，构建了四重生物活性纳米药物FANDHP@FuEVs。该体系首先将M2型巨噬细胞来源细胞外囊泡（M2-EVs）与间充质干细胞来源细胞外囊泡（MSC-EVs）融合，获得具有双重炎症趋向性的融合细胞外囊泡（FuEVs）；随后进一步装载肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）和多烯磷脂酰胆碱（polyene phosphatidylcholine，PPC）。

这一设计使FANDHP@FuEVs中的四类组分均具有生物活性：M2-EVs主要参与抗氧化及巨噬细胞再极化，MSC-EVs发挥抗炎和促再生作用，HGF促进肝细胞增殖及组织修复，PPC则有助于减轻氧化损伤、维护肝细胞膜结构。研究结果显示，FANDHP@FuEVs能够在对乙酰氨基酚和肝切除诱导的两种小鼠ALF模型中向损伤肝脏富集，并协同发挥抗氧化、抗炎、促进肝细胞再生及调节巨噬细胞极化等作用。需要强调的是，该研究的治疗证据主要来自细胞及动物实验，患者数据主要用于说明药物损伤和手术损伤与肝衰竭的临床相关性，并非人体治疗试验。

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【摘 要】

急性肝衰竭（acute liver failure，ALF）以严重肝细胞坏死和较高死亡率为主要特征，仍是全球面临的重要健康挑战。目前，临床上尚缺乏有效的药物治疗方案。

本研究受到全药物活性成分纳米药物（full-API nanodrug，FAND）新概念的启发，合理设计了一种完全由活性药物成分构成的四重生物活性FAND，命名为FANDHP@FuEVs。

FANDHP@FuEVs以融合细胞外囊泡（fusion extracellular vesicles，FuEVs）为基础。FuEVs由M2型巨噬细胞来源细胞外囊泡（M2-EVs）与间充质干细胞来源细胞外囊泡（MSC-EVs）融合构建，随后进一步装载两种具有临床治疗基础的生物大分子，即肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）和多烯磷脂酰胆碱（polyene phosphatidylcholine，PPC）。

得益于FuEVs所具有的双重内源性炎症趋向能力，FANDHP@FuEVs能够有效靶向受损肝脏。同时，该体系整合M2-EVs、MSC-EVs、HGF和PPC四种天然或临床应用的活性组分，协同发挥抗氧化、抗炎、促进组织再生及促进巨噬细胞再极化等多效治疗作用。

研究结果表明，FANDHP@FuEVs对对乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）和肝切除诱导的两种实验性ALF均具有干预作用。患者临床资料也表明，药物损伤和外科手术损伤均可造成严重肝功能异常，为建立两类动物模型提供了临床依据。

总体而言，利用天然来源或已获临床应用的活性药物成分构建全生物活性纳米药物，为开发安全、多功能且具有多重作用机制的ALF干预体系提供了新的研究方向。

01

研究背景及科学问题

急性肝衰竭通常伴随大范围肝细胞坏死、急性肝功能障碍及危及生命的并发症，具有较高死亡风险。药物性损伤、外科肝切除和自身免疫性疾病等多种因素均可能诱发ALF。

目前，人工肝支持系统和原位肝移植是临床处理ALF的重要手段，但二者均面临明显限制，包括供体短缺、手术费用较高以及移植后需要长期使用免疫抑制剂等。更重要的是，目前仍缺乏能够广泛用于ALF临床治疗的有效药物。因此，开发安全、高效且具有较广适用范围的肝功能修复策略仍十分必要。

近年来，先进纳米药物在ALF基础研究和临床转化方面显示出一定潜力。不过，传统纳米药物通常存在三方面局限。

首先，由于制剂中含有较高比例的结构脂质、赋形剂等非治疗性成分，其活性药物成分装载量通常低于总质量的10%。其次，介孔二氧化硅等惰性载体及复杂表面修饰材料可能存在生物降解能力不足和长期清除困难等安全问题。再次，部分纳米药物依赖单一治疗机制或单纯依靠增强渗透与滞留效应实现靶向，而这一效应在不同患者和疾病状态之间存在明显异质性，因而可能限制实际治疗效果。

针对这些问题，研究者近期提出了全药物活性成分纳米药物的概念。FAND由100%的活性药物成分组成，有望减少惰性材料占比并提高活性组分负载量。不过，现有FAND多由已获批的小分子药物和人体必需金属离子构成，生物活性和仿生功能仍相对有限。

细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）由多种细胞自然分泌，具有内源性生物活性、较好的生物相容性、较低免疫原性，以及来源细胞所赋予的特定功能。因此，EVs不仅可作为递送载体，也可作为具有治疗活性的组成单元，为构建新型生物活性FAND提供基础。

在本研究中，研究团队设计并构建了四重生物活性FANDHP@FuEVs，用于干预APAP或肝切除诱导的ALF。

FuEVs由M2-EVs与MSC-EVs融合形成。两种EVs均携带来源细胞的趋化因子和功能性趋化受体，可参与炎症信号引导的迁移和免疫细胞募集。融合后，这种内源性炎症趋向能力仍得到保留，使FANDHP@FuEVs能够更有效地向肝损伤部位富集。

该体系中的四种活性组分通过不同但互补的机制参与肝脏修复：M2-EVs发挥抗氧化作用并促进巨噬细胞由M1型向M2型转变；MSC-EVs抑制炎症并促进肝细胞再生；HGF促进肝细胞生长和组织修复；PPC则发挥抗氧化及肝细胞保护作用，并帮助维持肝细胞结构完整性。

研究进一步在APAP和肝切除诱导的两种小鼠ALF模型中评价该体系，以分别模拟药物毒性和外科手术造成的肝损伤。研究目标是建立一种由天然活性组分及临床应用生物大分子共同构成的多功能纳米干预体系，并评价其肝脏靶向、抗氧化、抗炎、促再生和免疫调节作用。

02

重要发现及亮点

患者资料显示药物损伤和肝切除均可造成严重肝功能异常

研究团队首先收集了药物性肝损伤患者以及接受肝切除患者的临床资料，以评估两类损伤与ALF之间的关系，并为后续建立动物模型提供依据。

组织学检查显示，药物诱导ALF患者的肝组织中存在明显炎症细胞浸润。发生药物性损伤后，患者血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）、凝血酶原时间（PT）、国际标准化比值（INR）和碱性磷酸酶（ALP）均明显升高并超出正常范围，提示存在肝衰竭风险。

对于需要接受肝切除的肝癌患者，研究利用三维虚拟肝切除技术规划手术范围，并通过CT图像显示肿瘤、保留肝组织和切除区域。术后ALT、AST、γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT）、TBIL、DBIL、PT及INR等指标出现明显变化，提示肝切除可造成显著肝组织损伤和肝功能障碍。

这些临床资料说明，药物毒性和外科手术损伤均可引发严重肝功能异常，为采用APAP和肝切除分别建立两类ALF小鼠模型提供了依据。

图1：ALF患者中药物诱导或外科切除诱导肝损伤的鉴定。（a）一例发生药物性损伤的代表性ALF患者；（b）药物诱导ALF患者肝组织的苏木精-伊红（H&E）染色切片，比例尺=100 μm；（c）药物性损伤后血清ALT、AST、TBIL、DBIL、PT、INR和ALP水平的变化；（d）一例发生外科手术损伤的代表性ALF患者；（e）三维虚拟肝切除显示完整肝脏、肿瘤及肝内管道结构，其中红色表示动脉，浅绿色表示门静脉，深绿色表示扩张胆管，蓝色表示肝静脉；（f）患者肝切除术后的CT图像，其中红色表示保留肝组织，黄色表示肿瘤，蓝色表示切除肝组织；（g）肝切除术前后血清ALT、AST、TBIL、DBIL、γ-GT、PT和INR水平的配对比较。原图注未注明样本量。

四重生物活性FAND的设计与作用框架

研究提出的FANDHP@FuEVs由四种具有生物活性的药物组成单元构成。M2-EVs与MSC-EVs先通过膜融合形成FuEVs，再通过电穿孔装载HGF和PPC。

FuEVs同时保留两种来源EVs的炎症趋向及生物调节特征，使纳米药物能够向炎症性肝损伤部位迁移。进入损伤肝脏后，四类组分分别参与清除活性氧、降低促炎因子、提高抗炎因子、促进M1型巨噬细胞向M2型转变，并支持肝细胞增殖和肝功能恢复。

示意图1：用于治疗APAP和肝切除诱导急性肝衰竭的四重生物活性全药物活性成分纳米药物FANDHP@FuEVs的设计及多效生物学功能示意图。该体系由M2-EVs、MSC-EVs、HGF和PPC四种活性组成单元构成，具备双重炎症趋向能力，并协同发挥抗氧化、抗炎、促进肝细胞再生及促进巨噬细胞再极化等作用。

M2-EVs、MSC-EVs和融合细胞外囊泡的制备与鉴定

M1型巨噬细胞主要表现出促炎特征，而M2型巨噬细胞则参与抑制氧化应激和调节炎症微环境。为获得M2-EVs，研究采用IL-4和IL-13各100 ng/mL处理RAW264.7细胞24小时，诱导M0型巨噬细胞向M2型极化。与此同时，使用1 μg/mL脂多糖（LPS）处理约24小时，建立M1型巨噬细胞。

共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）检测显示，诱导后的M2型细胞表达CD206，M1型细胞表达CD80。流式细胞术测得M2和M1极化比例分别为37.0%和25.8%。ELISA结果显示，极化后M2相关因子IL-10和精氨酸酶1（Arg-1）升高，而M1相关因子IL-6和TNF-α则呈现相应的表达变化，证实两类巨噬细胞极化成功。

随后，研究采用差速超速离心法分别提取M2-EVs和MSC-EVs。透射电子显微镜（TEM）显示两类EVs均具有典型囊泡结构。流式细胞术进一步检测到共同EV标志物CD81和CD63，以及M2-EVs标志物CD206和MSC-EVs标志物CD105，证实两类EVs成功获得。

融合细胞外囊泡成功装载HGF和PPC

考虑到聚乙二醇分子量会影响膜融合效率，研究使用PEG4000诱导M2-EVs与MSC-EVs融合。TEM、共聚焦成像和荧光共振能量转移（FRET）分析均证实FuEVs成功形成。

研究通过MTT实验筛选HGF和PPC的使用浓度。在保证细胞活力超过80%的条件下，最终选择HGF 200 ng/mL和PPC 100 μM进行后续装载。两者通过电穿孔进入FuEVs，形成FANDHP@FuEVs。ELISA和紫外-可见吸收光谱进一步证实HGF和PPC装载成功。

纳米颗粒跟踪分析显示，M2-EVs、MSC-EVs、FuEVs和FANDHP@FuEVs的平均粒径分别为121.5、142.3、240.9和346.1 nm，相应Zeta电位分别约为−17.4、−20.7、−13.9和−14.5 mV。与单一来源EVs相比，融合和装载后囊泡粒径有所增大。FuEVs和FANDHP@FuEVs在磷酸盐缓冲液中均表现出较好的稳定性。

图2：M2-EVs、MSC-EVs、FuEVs及FANDHP@FuEVs的制备与表征。（a）巨噬细胞极化流程示意图；（b）M2型巨噬细胞和M1型巨噬细胞极化后的CLSM图像，分别采用FITC标记的抗小鼠CD206抗体和FITC标记的抗小鼠CD80抗体进行检测，比例尺=50 μm；（c）流式细胞术分析M2和M1型巨噬细胞表面的CD206和CD86表达；（d）M2型巨噬细胞标志因子IL-10和Arg-1，以及M1型巨噬细胞标志因子IL-6和TNF-α的水平变化，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；（e）M2-EVs的TEM和共聚焦图像，TEM比例尺=100 nm，共聚焦图像比例尺=10 μm；（f）MSC-EVs的TEM和共聚焦图像，TEM比例尺=100 nm，共聚焦图像比例尺=10 μm；（g）流式细胞术分析M2-EVs表面的CD206和CD81表达；（h）流式细胞术分析MSC-EVs表面的CD105和CD63表达，单阳性对照采用与实验组相同荧光基团标记的相应标志蛋白；（i）FuEVs的TEM和共聚焦图像，插图为未进行融合的囊泡混合组，TEM比例尺=100 nm，共聚焦图像比例尺=10 μm；（j）不同浓度HGF和PPC处理后的细胞毒性，其中HGF浓度分别为0、20、50、100、200和400 ng/mL，PPC浓度分别为0、2.5、5、10、20、50、100、200和400 μM；（k）FANDHP@FuEVs的TEM图像，比例尺=500 nm；（l）HGF和PPC的紫外吸收曲线；（m）M2-EVs、MSC-EVs、FuEVs和FANDHP@FuEVs的粒径及Zeta电位，n=3。

miRNA测序揭示融合囊泡的潜在再生和代谢调节功能

为了比较FuEVs与两类单一来源EVs的生物学差异，研究对M2-EVs、MSC-EVs和FuEVs开展miRNA测序分析。

与M2-EVs相比，FuEVs中与肝脏再生和肝细胞增殖相关的miR-155和miR-122表达升高。与MSC-EVs相比，FuEVs中的miR-103上调最为明显。作者认为，这些变化可能参与肝脏微环境调节，并为肝细胞再生和组织修复提供基础。

按照倍数变化大于1且校正后p<0.05的标准，研究筛选差异上调miRNA对应的预测靶基因。FuEVs与M2-EVs比较获得592个相关靶基因，FuEVs与MSC-EVs比较获得2579个相关靶基因。

基因本体论（GO）富集分析显示，这些靶基因主要涉及生物学过程正向调控、G蛋白偶联受体信号、细胞通信及细胞大分子定位等过程。京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析显示，相关靶基因富集于MAPK信号、轴突导向、蛋白质消化与吸收等通路。这些通路可能分别参与细胞增殖、肝脏血管再生及全身营养供应。

图3：融合囊泡与单一来源囊泡M2-EVs和MSC-EVs的miRNA分析与比较。（a）FuEVs与M2-EVs之间差异表达miRNA的火山图；（b）FuEVs与MSC-EVs之间差异表达miRNA的火山图；（c）两个比较组中10个上调miRNA靶基因的气泡图；（d）FuEVs与M2-EVs之间差异表达miRNA靶基因的GO富集网络；（e）FuEVs与MSC-EVs之间差异表达miRNA靶基因的GO富集网络；（f）FuEVs与M2-EVs之间差异表达miRNA靶基因的KEGG通路富集分析；（g）FuEVs与MSC-EVs之间差异表达miRNA靶基因的KEGG通路富集分析。原图注未注明样本量。

FANDHP@FuEVs可被肝细胞摄取并具有良好细胞相容性

研究使用M2-EVs来源标志物CD206和MSC-EVs来源标志物CD105，观察AML12小鼠肝细胞对FuEVs和FANDHP@FuEVs的摄取。共聚焦成像显示，AML12细胞中同时出现两种来源标志物的荧光信号，说明融合囊泡能够被肝细胞摄取。

研究还制备了吲哚菁绿（indocyanine green，ICG）负载的FANDHIP@FuEVs。细胞内ICG荧光及其定量结果进一步证实，AML12细胞能够有效摄取该融合囊泡递送体系。

细胞毒性实验显示，在所检测的不同浓度范围内，FANDHP@FuEVs对AML12和RAW264.7细胞均未产生明显毒性，部分浓度下还可促进细胞生长，表明该体系在细胞水平具有较好的生物相容性。

FANDHP@FuEVs协同降低肝细胞氧化应激和炎症反应

为模拟ALF中的氧化应激微环境，研究采用过氧化氢（H2O2）处理AML12细胞，诱导活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成。

实验发现，与健康肝细胞相比，炎症状态下的肝细胞更容易摄取EVs，其中FuEVs的摄取水平尤其明显。FANDHP@FuEVs的细胞摄取量也高于单独使用M2-EVs或MSC-EVs，提示融合工程增强了EVs原有的炎症靶向特性。

DCFH-DA荧光染色和流式细胞术结果表明，HGF、PPC和FuEVs均具有一定的抗氧化作用，而整合四类组分的FANDHP@FuEVs清除ROS的作用最为明显。

与此同时，FANDHP@FuEVs降低了细胞上清液中IL-6和TNF-α水平。CCK-8检测显示，其还可提高H2O2损伤后AML12细胞的存活率，支持四种活性组分在抗氧化、抗炎和细胞修复方面产生协同作用。

图4：FANDHP@FuEVs在受损肝细胞中的摄取和修复作用。（a）AML12细胞摄取FuEVs及FANDHP@FuEVs的共聚焦图像，CD105为蓝色，CD206为绿色，比例尺=50 μm；（b）AML12细胞摄取游离ICG和ICG负载FANDHIP@FuEVs的共聚焦图像，ICG为红色，比例尺=50 μm；（c）AML12细胞中CD206、CD105和ICG的荧光强度；（d）FANDHP@FuEVs对AML12细胞的细胞毒性分析；（e）FANDHP@FuEVs对RAW264.7细胞的细胞毒性分析；（f）FANDHP@FuEVs处理前后炎症性肝细胞中IL-6、TNF-α和ROS水平变化的示意图；（g）采用DCFH-DA染色检测不同处理组AML12细胞中的ROS水平，ROS为绿色。分组包括对照组、H2O2组、H2O2+HGF组、H2O2+PPC组、H2O2+FuEVs组和H2O2+FANDHP@FuEVs组，比例尺=50 μm；（h）各处理组ROS平均荧光强度；（i）各处理组细胞上清液中IL-6水平；（j）各处理组细胞上清液中TNF-α水平；（k）各处理组细胞活力。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。原图注未注明样本量。

FANDHP@FuEVs促进巨噬细胞由M1型向M2型再极化

M1型巨噬细胞在损伤肝脏中参与促炎反应，而M2型巨噬细胞有助于抑制炎症并促进组织修复。因此，推动M1型巨噬细胞向M2型再极化，可能有助于改善ALF中的炎症微环境。

共聚焦成像显示，随着FANDHP@FuEVs处理时间延长，M2型巨噬细胞比例逐渐增加，而M1型巨噬细胞比例下降。流式细胞术同样显示，处理后M1相关标志物总体减少，M2相关标志物增加。

由于CD80和CD86在不同极化阶段可能呈现不同表达动态，CD86/CD206和CD80/CD206比值之间存在一定差异。不过，整体结果均显示巨噬细胞由促炎M1表型向M2表型转变。

qRT-PCR进一步显示，FANDHP@FuEVs可上调M2相关基因Mrc1和Arg1，并抑制M1相关基因Cd86和Nos2。ELISA结果显示，M2相关抗炎因子IL-10和标志蛋白Arg-1水平升高，进一步支持FANDHP@FuEVs具有促进巨噬细胞再极化的作用。

FANDHP@FuEVs促进受损肝细胞迁移和再生

研究通过细胞划痕实验评价FANDHP@FuEVs对肝细胞再生和修复的影响。

与PBS组相比，FANDHP@FuEVs处理组的划痕面积明显缩小，处理24小时后划痕区域几乎完全闭合。HGF、PPC和FuEVs单独处理也表现出一定促迁移作用，但完整FANDHP@FuEVs体系的修复作用最为明显。

这些结果说明，四类活性组分的协同作用能够促进AML12肝细胞迁移，并支持受损肝细胞的再生修复。

图5：FANDHP@FuEVs对巨噬细胞再极化及受损肝细胞再生的影响。（a）验证FANDHP@FuEVs促进巨噬细胞再极化作用的实验流程示意图；（b）FANDHP@FuEVs诱导再极化过程中M1和M2型巨噬细胞标志蛋白的共聚焦图像，CD86为绿色，CD206为红色，比例尺=50 μm；（c）FANDHP@FuEVs诱导再极化过程中M1和M2型巨噬细胞荧光强度的变化；（d）流式细胞术分析FANDHP@FuEVs的再极化作用；（e）FANDHP@FuEVs处理后IL-10水平的变化；（f）FANDHP@FuEVs处理后Arg-1水平的变化；（g）健康肝细胞分别接受FANDHP@FuEVs及各单独组分处理后，划痕面积在0、12和24小时的变化，比例尺=200 μm；（h）FANDHP@FuEVs组和各单独组分处理组划痕面积变化的统计分析。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。原图注未注明样本量。

FANDHP@FuEVs靶向APAP诱导的肝损伤

研究采用腹腔注射APAP 350 mg/kg建立小鼠ALF模型。建模24小时后，模型小鼠肝脏表面明显粗糙。H&E染色显示，肝细胞出现核固缩、核碎裂和明显胞质空泡化，血清ALT和AST显著升高，说明ALF模型构建成功。

为评价肝脏靶向能力，研究以ICG标记融合囊泡。离体器官成像显示，FANDHIP@FuEVs主要富集于炎症性肝脏。活体成像进一步显示，与游离ICG相比，FANDHIP@FuEVs在静脉注射后2小时内即可迅速在肝区积聚，并维持较长时间的荧光信号。

FANDHP@FuEVs改善APAP诱导小鼠的肝功能和组织损伤

研究分别给予PBS、HGF、PPC、FuEVs和FANDHP@FuEVs。治疗后，FANDHP@FuEVs组的ALT、AST和TBIL等肝功能指标明显改善，尿素和肌酐等肾功能指标也呈恢复趋势。

治疗14天后的组织学结果显示，与PBS组相比，各干预组肝组织结构均有不同程度改善。FANDHP@FuEVs组的肝细胞排列更加完整，Ki67阳性细胞增加，而TUNEL阳性细胞减少，提示肝细胞增殖增强、细胞死亡减少。

FANDHP@FuEVs和FuEVs均显著降低血清IL-6和TNF-α水平。这种共同的抗炎作用可能主要来自FuEVs所具有的靶向免疫调节功能。

治疗期间，各组小鼠体重未出现明显异常变化，且干预组具有较高生存率。结果表明，FANDHP@FuEVs能够在APAP诱导的ALF小鼠中向肝脏富集，并协同发挥抗炎、促进肝细胞再生和修复肝损伤等作用。

图6：APAP诱导ALF模型中的肝功能恢复。（a）APAP诱导小鼠ALF模型的建立与治疗流程示意图；（b）健康小鼠和ALF模型小鼠肝脏的代表性大体图像及H&E染色切片，低倍图比例尺=200 μm，高倍图比例尺=50 μm；（c）在APAP诱导ALF小鼠模型中，注射游离ICG或FANDHIP@FuEVs 2小时后，其在主要器官中的分布；（d）主要器官荧光强度的定量分析；（e）游离ICG和FANDHIP@FuEVs在ALF模型小鼠体内0～36小时的分布；（f）不同处理组的血清肝功能指标AST、ALT和TBIL，其中正常范围分别为AST 15～120 U/L、ALT 5～40 U/L、TBIL 1.7～17 μmol/L；（g）健康组、模型组、HGF组、PPC组、FuEVs组和FANDHP@FuEVs组的肾功能指标尿素和肌酐；（h）不同处理后肝组织H&E、Ki67和TUNEL染色的代表性图像，比例尺均为100 μm；（i）不同处理后ALF小鼠血清IL-6和TNF-α水平的变化；（j）各处理组小鼠体重变化。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。原图注未注明样本量。

FANDHP@FuEVs靶向肝切除诱导的肝损伤

为进一步验证该体系对不同病因ALF的适用性，研究建立了肝切除诱导的小鼠ALF模型。研究按照临床外科操作切除约三分之二肝组织。

术后24小时，模型小鼠残余肝组织出现明显缺血改变。H&E染色显示广泛肝细胞损伤，包括核固缩和胞质空泡化，血清ALT和AST显著升高，证实模型建立成功。

离体器官成像显示，FANDHIP@FuEVs可明显富集于损伤肝脏。活体成像也显示，FANDHIP@FuEVs能够较快到达残余肝组织并在肝区形成较强荧光信号。

FANDHP@FuEVs促进肝切除后肝组织再生

治疗14天后，FANDHP@FuEVs显著改善ALT、AST和TBIL等肝功能指标，并改善尿素和肌酐等肾功能相关指标。

大体观察显示，FANDHP@FuEVs组的残余肝组织色泽和灌注状态优于模型组。H&E染色显示肝组织炎症细胞浸润减少，Ki67染色显示肝细胞增殖增强，TUNEL染色则显示肝细胞死亡减少。

肝再生指数分析表明，HGF、PPC、FuEVs和FANDHP@FuEVs均可在一定程度上促进肝组织生长，其中FANDHP@FuEVs的再生促进作用最为明显。

FANDHP@FuEVs还降低了血清IL-6和TNF-α水平。14天治疗期间，各组小鼠体重未出现显著差异，生存分析也显示该体系具有较好的初步安全性。

上述结果表明，FANDHP@FuEVs能够在肝切除诱导的ALF模型中向受损肝脏富集，并通过减轻炎症、促进肝细胞增殖及改善肝肾功能，支持残余肝组织的再生修复。

图7：肝切除诱导ALF模型中的肝功能恢复。（a）肝切除诱导小鼠ALF模型的建立与治疗流程示意图；（b）正常小鼠和ALF模型小鼠肝脏的代表性大体图像及H&E染色切片，低倍图比例尺=200 μm，高倍图比例尺=50 μm；（c）在肝切除诱导ALF小鼠模型中，注射游离ICG或FANDHIP@FuEVs 2小时后，其在主要器官中的分布；（d）主要器官荧光强度定量分析；（e）游离ICG和FANDHIP@FuEVs在ALF模型小鼠体内0～36小时的分布；（f）不同处理组血清肝功能指标AST、ALT和TBIL，其中正常范围分别为AST 15～120 U/L、ALT 5～40 U/L、TBIL 1.7～17 μmol/L；（g）健康组、模型组、HGF组、PPC组、FuEVs组和FANDHP@FuEVs组的肾功能指标尿素和肌酐；（h）不同处理后肝组织H&E、Ki67和TUNEL染色的代表性图像，其中H&E和Ki67图像比例尺=100 μm，TUNEL图像比例尺=50 μm；（i）不同处理组的肝再生指数；（j）不同处理后ALF小鼠血清IL-6水平的变化；（k）血清TNF-α水平的变化；（l）各处理组小鼠体重变化。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。原图注未注明样本量。

FANDHP@FuEVs在健康小鼠中表现出良好的初步生物安全性

在APAP及肝切除诱导的ALF模型中，治疗14天后，各组小鼠的心、脾、肺、肾和肠组织均未见明显组织损伤或病理异常。

研究还将FANDHP@FuEVs经尾静脉注射至健康小鼠，进一步评价其全身生物相容性。结果显示，与健康对照组相比，FANDHP@FuEVs组小鼠的ALT、AST、肌酐、血尿素氮（BUN）和总胆固醇（TC）均未出现显著异常。

血常规检测显示，白细胞（WBC）、红细胞（RBC）、血红蛋白（HGB）和血小板（PLT）计数无显著变化。心、肝、脾、肺、肾和肠组织的H&E染色也未见明显病变。

血清补体激活标志物C3a、C5a及可溶性终末补体复合物sC5b-9的比较结果显示，FANDHP@FuEVs未诱导明显补体激活，支持其具有较低免疫原性和良好的初步安全性。不过，研究观察期主要为14天，长期安全性仍需进一步评价。

图8：FANDHP@FuEVs的生物安全性评价。（a）健康小鼠与FANDHP@FuEVs注射组的ALT和AST水平比较；（b）肌酐水平比较；（c）BUN水平比较；（d）TC水平比较；（e）两组小鼠WBC计数比较；（f）RBC计数比较；（g）HGB水平比较；（h）PLT计数比较；（i）健康组和FANDHP@FuEVs注射组小鼠心、肝、脾、肺、肾和肠组织的H&E染色，比例尺=50 μm。图中ns表示差异无统计学意义。原图注未注明样本量。

【贡献】★★★★★

本研究以全药物活性成分纳米药物理念为基础，构建了一种由两种天然来源细胞外囊泡和两种具有临床应用基础的生物大分子组成的四重生物活性FANDHP@FuEVs，用于干预APAP或肝切除诱导的实验性ALF。

M2-EVs与MSC-EVs融合形成的FuEVs赋予该体系双重内源性炎症趋向能力，使其能够向受损肝脏递送。装载的HGF和PPC则进一步提高了该体系促进肝细胞生长、组织修复和维持肝细胞结构完整性的能力。

细胞和动物实验表明，M2-EVs、MSC-EVs、HGF和PPC可协同发挥抗氧化、抗炎及促进巨噬细胞再极化的作用，同时促进肝细胞增殖和组织修复。FANDHP@FuEVs在APAP和肝切除诱导的两种小鼠ALF模型中均表现出肝损伤部位富集、改善肝功能、减轻炎症及促进肝组织再生等作用。

不过，该四重活性制剂仍有多个环节需要进一步优化。未来研究需要更加深入地阐明其具体作用机制，系统评价长期生物安全性，优化各活性组分之间的比例，并建立标准化、可规模化的制备流程。

总体而言，本研究拓展了细胞外囊泡和生物大分子在全活性纳米药物中的应用，为ALF及其他炎症性疾病的多组分协同干预提供了新的实验性纳米药物设计框架。现有结论主要来自体外实验和小鼠模型，其临床有效性及长期安全性仍需进一步研究。

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