Phytomedicine (IF11.3)--广州中医药大学 揭示培土清心方治疗特应性皮炎的新发现：关键在“miR-30a/GAPR-1”这条代谢轴~~

【写在前面】：本期推荐的是由广州中医药大学第二临床医学院、广州中医药大学第二附属医院等研究团队合作近期发表于Phytomedicine(IF11.3）的一篇文章，揭示培土清心方通过靶向miR-30a/GAPR-1轴改善特应性皮炎中的鞘脂代谢。

【期刊简介】

【题目及作者信息】

Peitu Qingxin formulaameliorates atopic dermatitis by targeting the multi-omics-informed miR-30a/GAPR-1 axis in sphingolipid metabolism

研究背景：

特应性皮炎（AD）是一种常见的慢性炎症性皮肤病，全球患者超过1.29亿人。其核心病理特征包括皮肤屏障功能受损和鞘脂代谢紊乱。鞘脂是真核细胞质膜的重要组成成分，其中神经酰胺（Ceramide）是角质层最主要的脂质，约占角质层总脂质质量的50%。在AD患者皮损中，总神经酰胺含量及特定神经酰胺亚类水平均发生显著改变。2型细胞因子可直接抑制神经酰胺相关酶活性，加剧炎症与屏障功能障碍的恶性循环。microRNA（miRNA）作为重要的转录后基因调控分子，在AD的发病机制中扮演着关键角色。然而，miR-30a在AD中的精确功能角色和下游机制尚不明确。

研究目的：

本研究旨在明确培土清心方（PTQX）在AD鞘脂代谢中的新机制，并验证miR-30a/GAPR-1轴作为AD治疗的潜在靶点。

研究方法：

临床与生信分析：整合孟德尔随机化（Mendelian Randomization）、临床血浆蛋白质组学筛查及双荧光素酶报告基因实验，发现miR-30a(3p)是AD的保护性因子，并证实其直接靶向GAPR-1。

3D皮肤模型验证：构建AD样3D皮肤等效物，通过miR-30a过表达验证其对GAPR-1的下调作用及对屏障功能的修复效果。

动物实验：在DNCB诱导的NC/Nga AD小鼠模型中确定PTQX的有效剂量，并在miR-30a基因敲除小鼠中评估PTQX的疗效。

多组学分析：结合DIA蛋白质组学和非靶向代谢组学，揭示PTQX调控鞘脂代谢的分子网络。

分子对接：预测PTQX中30种活性成分与GAPR-1蛋白的结合亲和力。

研究结果：

1. miR-30a(3p)靶向抑制GAPR-1构成AD的保护性调控轴

孟德尔随机化联合荟萃分析显示，hsa-miR-30a(3p)的高表达与AD发病风险呈显著负相关。临床血浆蛋白质组学发现，重症AD患者GAPR-1蛋白表达显著上调。组织水平上，AD皮损中hsa-miR-30a(3p)表达下降，而GAPR-1表达升高。双荧光素酶报告基因实验证实GAPR-1是miR-30a(3p)的保守靶基因。

2. miR-30a过表达恢复AD样3D皮肤屏障功能

在AD样3D皮肤等效物中，miR-30a过表达显著下调GAPR-1蛋白表达，同时使跨上皮电阻（TEER）显著升高、IL-8分泌显著降低。组织学检查显示表皮厚度恢复，屏障相关蛋白（丝聚合蛋白FLG、兜甲蛋白LOR、角蛋白10）表达恢复至接近正常水平。

3. PTQX通过调控miR-30a/GAPR-1轴改善AD症状

对PTQX进行化学成分分析，共鉴定出30种化合物，主要成分包括腺苷、L-异亮氨酸、异鼠李素、芦丁、连翘苷A和甘草酸等。在DNCB诱导的AD小鼠中，中剂量PTQX（14.45 g/kg/d）显著改善皮损表现，下调皮炎评分，减少耳厚度和经皮水分丢失（TEWL）。PTQX处理还恢复了皮肤中miR-30a(3p)和GAPR-1的表达至接近正常水平。

4. GAPR-1沉默改善AD病理并恢复鞘脂稳态

分子对接预测显示，PTQX中28种化合物与GAPR-1具有良好结合亲和力（< -5 kcal/mol），排名前六的化合物为Heterophyllin B、甘草酸、柠檬苦素、Licoricesaponin G2、黄柏酮和甘草苷芹糖苷。

通过腺病毒介导的GAPR-1沉默实验，发现shGAPR-1组小鼠皮炎评分显著降低、表皮厚度减少。靶向脂质组学分析揭示鞘脂代谢是GAPR-1功能的核心下游机制——AD诱导后11种鞘脂代谢物表达下降，GAPR-1抑制后这些代谢物水平得到部分恢复。其中Hex2Cer(d18:0/22:0)与AD表型及GAPR-1表达均呈显著负相关。

5. PTQX以miR-30a依赖性方式缓解AD样皮炎

miR-30a基因敲除显著加重AD样症状。PTQX治疗在KO小鼠中仍有效，但在WT小鼠中疗效更为显著，提示miR-30a是PTQX有效治疗反应不可或缺的介质。

6. PTQX通过miR-30a介导的信号轴改善AD炎症

血清细胞因子谱分析显示，miR-30a敲除显著加剧了炎症反应（7种介质上调），PTQX治疗显著下调其中6种。交集分析确定了一组核心炎症分子（KC、IL-5、IL-12p70、IL-10），这些分子因miR-30a缺陷而上调，但被PTQX持续抑制。在组织层面，PTQX显著抑制NLRP3和TLR2过表达，并上调CYP1A1。

7. PTQX调节miR-30a/GAPR-1轴恢复鞘脂稳态

蛋白质组学分析显示，miR-30a缺失显著扰动脂质代谢，鞘脂代谢是重要的失调通路。10种鞘脂代谢相关蛋白在KO-Model小鼠中显著下调，PTQX治疗逆转了其中大部分蛋白的抑制。非靶向代谢组学证实，KO-Model中10种鞘脂相关代谢物下调，PTQX治疗后其中7种得到部分恢复。关键鞘脂酶ENPP7和GBA的表达在PTQX治疗后显著上调。

研究结论：

本研究首次揭示了miR-30a/GAPR-1轴作为AD鞘脂代谢调控的关键检查点。培土清心方通过靶向这一信号轴，有效改善AD病理，为AD治疗提供了一种整合鞘脂代谢调控与炎症抑制的新策略。

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图文摘要

图1. 临床证据提示miR-30a(3p)靶向抑制GAPR-1可能构成AD的保护性调控轴。(A) 实验流程图。(B) hsa-miR-30a(3p)与AD的孟德尔随机化荟萃分析森林图。(C) 健康对照(n=9)与重症AD(n=8)血浆DIA蛋白质组火山图。(D) 两组间GAPR-1表达比较。(E-G) 人皮肤组织双标记FISH/IF显示：AD患者中miR-30a(3p)荧光强度显著降低(E)，GAPR-1荧光强度显著升高(F)；代表性融合图像(G，标尺50 μm)。(H-I) 双荧光素酶报告基因证实miR-30a(3p)直接靶向GAPR-1 3'UTR（人源H，鼠源I），野生型(WT)较突变型(MUT)及空载对照(NC)活性显著下降。

图2. 过表达miR-30a可下调GAPR-1，并恢复AD样3D皮肤等效模型的屏障完整性。 (A) 实验设计示意图。 (B-C) FISH/IF共染显示：AD模型组中miR-30a信号降低、GAPR-1升高；给予miR-30a模拟物（OE）后，miR-30a回升，GAPR-1被抑制（标尺20微米；半定量分析见C，n=3）。 (D-E) OE组跨上皮电阻（TEER）显著升高（D），IL-8分泌显著减少（E），提示屏障功能恢复和炎症缓解（n=3）。 (F-G) HE染色及LOR、FLG、K10免疫组化显示：OE组表皮厚度明显变薄，各分化标志物（LOR、FLG、K10）的积分光密度（IOD）均显著回升（标尺50微米；半定量见G，n=3）。

图3. PTQX的化学成分分析及其通过调控miR-30a/GAPR-1减轻DNCB诱导的NC/Nga小鼠AD。(A)(B)正、负离子模式化学成分分析。(C)DNCB诱导AD模型及PTQX给药实验时间线。(D)小鼠背部皮肤和左耳皮损代表性照片。(E-H)皮炎严重度评估（n=5）：背部皮炎评分(E)，左耳皮炎评分(F)，背部经皮水分丢失(TEWL)(G)，左耳厚度(H)。(I-K)背部皮肤双标记FISH/IF检测小鼠miR-30a(3p)和GAPR-1：(I)对照组、模型组和PTQX中剂量组（PTQX-M）的代表性荧光图像（单通道绿色为miR-30a，红色为GAPR-1，以及融合图），标尺200 μm；(J)小鼠miR-30a(3p)相对荧光强度定量（相对于对照组，n=3）；(K)GAPR-1相对荧光强度定量（相对于对照组，n=3）。

图4. 分子对接预测PTQX成分与GAPR-1高亲和力结合，且表皮GAPR-1沉默可改善AD病理并恢复皮肤鞘脂稳态。 (A) 分子对接展示PTQX化合物与GAPR-1蛋白的结合模式。 (B) 动物模型实验设计与处理方案示意图。 (C) 背部皮损代表性照片（左）及皮炎评分定量（右）（n=3–5），分组：对照组、阴性对照、GAPR-1 shRNA敲低组、GAPR-1过表达组、他克莫司阳性对照组。 (D) 皮肤HE染色代表性图像（左）及表皮厚度定量（右下）（n=3），标尺100 μm。 (E) 各组GAPR-1蛋白免疫印迹代表图（左）及相对蛋白水平定量（右）（n=3）。 (F-I) 皮肤样本靶向脂质组学分析（n=3–5）：(F) MSEA富集分析结果，左为NC vs Ctrl，右为NC vs shGAPR-1；(G) 鞘脂代谢相关代谢物在Ctrl、NC、shGAPR-1三组间的热图；(H) 鞘脂代谢物ROC曲线分析，左为NC vs Ctrl，右为NC vs shGAPR-1；(I) 鞘脂代谢物间Pearson相关性分析热图。

图5. PTQX以miR-30a依赖性方式减轻AD样皮炎。 (A) DNCB诱导AD模型及PTQX给药实验时间线。 (B) 小鼠背部皮肤和左耳皮损代表性照片。 (C-H) 皮炎严重度评估（n=3-4）：背部皮炎评分(C)，左耳皮炎评分(D)，背部经皮水分丢失(TEWL)(E)，左耳厚度(F)，10分钟搔抓行为定量(G)，血清IgE水平(ELISA)(H)。 (I) 各组心脏、肾脏、肝脏和肺脏组织代表性病理学图像（HE染色），标尺50 μm。

图6. PTQX通过靶向miR-30a介导的信号轴改善AD炎症。 (A-B) 血清细胞因子/趋化因子谱分析（n=3-4）：(A) WT-Model与KO-Model比较的火山图；(B) KO-Model与KO-PTQX比较的火山图，显示PTQX逆转了多个炎症相关因子的表达。 (C-F) 皮肤组织NLRP3(C)、COX2(D)、CYP1A1(E)和TLR2(F)的免疫印迹代表图，GAPDH为内参。 (G-J) 相应蛋白相对水平的定量分析（n=3），显示PTQX可显著下调这些炎症标志物。

图7. PTQX通过调节miR-30a/GAPR-1轴恢复AD中的鞘脂稳态。 (A) 小鼠背部皮肤蛋白质组学：GO和KEGG富集分析显示差异蛋白主要富集于鞘脂代谢等通路。 (B) 鞘脂代谢相关蛋白热图及ROC分析表明，PTQX可逆转模型鼠中改变的鞘脂蛋白表达。 (C) 非靶向代谢组学MSEA和KEGG分析显示鞘脂代谢途径显著改变。 (D) 鞘脂代谢物热图及Pearson相关性分析，鉴定了多个差异代谢物，包括L-丝氨酸、植物鞘氨醇、N-乙酰二氢鞘氨醇、多种神经酰胺（如Cer(d18:1/18:3-OH)、Cer(d18:0/18:0)、Cer(d18:1/18:1-O)）及鞘磷脂等。 (E-F) 免疫印迹验证ENPP7、PSAP、GBA及GAPR-1蛋白表达，PTQX可上调ENPP7、PSAP、GBA并抑制GAPR-1。

总结

该研究不仅为培土清心方的临床应用提供了坚实的科学依据，也为开发PTQX来源的活性化合物或miR-30a模拟物/GAPR-1抑制剂用于AD治疗奠定了基础。这一发现体现了中医药“多成分、多靶点”的整体治疗优势，为传统方剂的现代化研究提供了新范式。

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