《食品科学》：北京市海淀区疾病预防控制中心张文隽主管技师等：高效液相色谱-原子荧光光谱法测定茶叶中硒形态

硒是维持人与动物正常生理活动所必需的微量元素，具有抗氧化、免疫调节及参与多种特定代谢途径等重要生物学功能。硒缺乏与人类心肌病等疾病及动物肝坏死、肌营养不良等病症密切相关。中国约51%的国土存在土壤缺硒现象，导致水体、植物、膳食及人发中的硒含量普遍偏低。但硒摄入并非越多越好，硒摄入过多可能会引发硒中毒，造成机体损伤。在所有元素中，硒的膳食摄入量的安全范围与毒性水平之间的差距极为狭窄，其毒性程度可能取决于化学形态。硒的形态包括有机硒（硒与碳之间有一个或多个化学键），例如硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸，以及无机硒（不含碳），例如亚硒酸盐和硒酸盐；无机和有机形态具有不同的生物学特性。无机硒的需要量和中毒量之间相差较小且生物利用率低，而有机硒的毒性小、生物利用率较好。

中国的茶文化历史源远流长。茶树是一种能够吸收并储存硒的植物，在我国不仅种植面积广泛，而且适应性强，普及程度也远超其他植物。除了硒之外，它所含有的茶多酚和茶色素等活性成分，赋予了茶叶抗氧化和抗癌等特性，对健康大有裨益。由于硒无法由人体自行合成，必须通过饮食进行补充，因此富含硒的茶品成为了一个极佳的选择。同时由于硒的毒性与其形态息息相关，因此也应该对茶叶中硒的形态分布给予充分的关注。

目前，硒形态分析中常见的方法包括高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法和高效液相色谱-原子荧光光谱法，其中高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法研究报道较为广泛，而高效液相色谱-原子荧光光谱法凭借仪器结构简单、成本较低等优势，更适用于基层推广。基于此，北京市海淀区疾病预防控制中心的张文隽、崔悦、王旭阳选用高效液相色谱-原子荧光光谱法，对色谱柱选择、流动相分离条件、氢化物发生条件及前处理方式进行优化，旨在缩短流动相分离时间、提升检测效率并改进处理流程，建立一种效率高、成本低、操作简便且稳定性较好的5 种形态硒检测方法，为富硒产品质量监控提供技术支撑。

1 色谱条件选择

1.1 色谱柱及流动相选择

目前硒形态测定主要采用两种色谱柱，分别是C18和阴离子色谱柱。根据文献[28]，C18色谱柱采用5%甲醇、30 mmol/L磷酸氢二铵和0.5 mmol/L四丁基溴化铵为流动相，结果发现此条件下分离情况不稳定，流动相平衡30 min后，各峰之间难以分离且各平行之间重复性极差，尤其是MeSeCys、Se(IV)、SeMet分离效果差，因此采用阴离子PRP-X100色谱柱。

采用不同浓度柠檬酸、磷酸氢二铵以及两者同时作为流动相，如图1所示，单独以柠檬酸为流动相时，5 mmol/L柠檬酸分离效果好于10 mmol/L 柠檬酸，但MeSeCys和Se(IV)之间无法完全分离，单独以40 mmol/L磷酸氢二铵为流动相时，分离效果好，但保留时间近23 min。将二者结合，当磷酸氢二铵浓度为40 mmol/L时，柠檬酸浓度为5、10 mmol/L 和15 mmol/L时，保留时间明显缩短，柠檬酸浓度为5 mmol/L时分离效果好，因此选择5 mmol/L为流动相柠檬酸浓度。当柠檬酸浓度固定为5 mmol/L时，采用不同浓度的磷酸氢二铵为流动相，分别为30、40、50、60 mmol/L和70 mmol/L，结果如图2所示，磷酸氢二铵浓度为30 mmol/L和40 mmol/L时各峰之间可完全分离，且40 mmol/L保留时间更短，磷酸氢二铵浓度增加至50、60 mmol/L和70 mmol/L时MeSeCys和Se(IV)之间逐渐无法分离，因此选择流动相为40 mmol/L磷酸氢二铵+5 mmol/L柠檬酸。

1.2 流动相pH值的影响

不同pH值条件下硒形态和固定相发生的作用不同，因此流动相pH值的变化与色谱柱的分离性能息息相关。以40 mmol/L磷酸氢二铵+5 mmol/L柠檬酸为流动相，用50%甲酸溶液调节流动相pH值，考察不同pH值条件下流动相的分离情况，pH值分别为5.2、4.9、4.6、4.3和4.0。如图3所示，pH值为5.2、4.9和4.6时MeSeCys和Se(IV)两峰之间部分重叠，pH值为4.3和4.0时可完全分离，随着pH值逐渐减小，MeSeCys和Se(IV)的两峰之间逐渐可以分离，Se(IV)和Se(VI)两峰出峰时间逐渐后移，保留时间也逐渐增加。为了兼顾分离度和工作效率，故而pH值选为4.3。

1.3 梯度洗脱时间的影响

液相色谱分离常采用梯度洗脱改善分离效果和提高效率。由图3可知，以40 mmol/L磷酸氢二铵+5 mmol/L 柠檬酸为流动相，pH值为4.3时，保留时间为15 min，分析时间较长，不利于样品快速检测，然而SeCys2、MeSeCys、Se(IV)和SeMet可在7 min内完成分离，只有Se(VI)长达15 min出峰，故而尝试梯度洗脱法。如图2所示，随着磷酸氢二铵浓度增大，Se(VI)出峰时间逐渐缩短，但单纯用高浓度磷酸氢二铵时，MeSeCys和Se(IV)之间难以分离，故以40 mmol/L磷酸氢二铵+5 mmol/L柠檬酸（pH 4.3）为流动相A，60 mmol/L磷酸氢二铵+5 mmol/L柠檬酸（pH 4.3）为流动相B，梯度洗脱，通过调节流动相A和流动相B的进入时间，使得前期MeSeCys和Se(IV)分离完全，后期Se(VI)出峰快，既保证分离度又保证样品检测时间。进一步尝试更改梯度洗脱时间，流动相A和流动相B的更改时间分别如以下方案：1）0～3 min，100% A、0% B；3～8 min，100%～0% A、0%～100% B；8～12.1 min，0% A、100% B。2）0～2.5 min，100% A、0% B；2.5～6.5 min，100%～0% A、0%～100% B；6.5～11.8 min，0% A、100% B。3）0～2.5 min，100% A、0% B；2.5～3.5 min，100%～0% A、0%～100% B；3.5～10.7 min， 0% A、100% B。4）0～1 min，100% A、0% B；1～1.5 min，100%～0% A、0%～100% B；1.5～10 min，0% A、100% B。5）0% A、100% B。由图4可知，用流动相A平衡色谱柱，全部更改为流动相B 的时间逐渐提前时，Se(VI)的保留时间逐渐缩短，但如若从0 min起直接使用100%流动相B，MeSeCys和Se(IV)的峰有所重叠，无法完全分离，且整体保留时间比方案4条件下延长，因此考虑分离效果和工作效率，选择流动相为：0～1 min，100% A、0% B；1～1.5 min，100%～0% A、0%～100% B；1.5～10 min，0% A、100% B。

1.4 流速的影响

流动相流速会影响液相色谱分离和保留时间，一般在0.8～1.2 mL/min。在以40 mmol/L磷酸氢二铵+5 mmol/L柠檬酸（pH 4.3）为流动相A，60 mmol/L磷酸氢二铵+5 mmol/L柠檬酸（pH 4.3）为流动相B，在梯度洗脱（0～1 min，100% A、0% B；1～1.5 min，100%～0% A、0%～100% B；1.5～10 min，0% A、100% B）的条件下，分别测试流速为0.8、1.0、1.1 mL/min和1.2 mL/min对5 种形态硒的影响。在流速为0.8 mL/min时，保留时间接近11.5 min，流速越大，保留时间越短，当流速为1.2 mL/min时，保留时间在8.5 min内，但此时SeCys2和MeSeCys两峰之间的分离度有所降低，综合考虑分离度、效率等情况，最终选择流速为1.1 mL/min，可保证在9 min内完成5 种形态硒分离。与现有大部分文献相比，此保留时间有所缩短，提高了方法的效率。

2 氢化物发生条件选择

2.1 盐酸体积分数

在原子荧光实验中，酸浓度对氢化物发生有一定影响，分别测试盐酸溶液体积分数为10%、15%、20%、25%和30%时的响应效果。随着盐酸体积分数增大，MeSeCys、Se(IV)和Se(VI)在20%时响应值最佳，SeCys2和SeMet峰面积呈上升趋势，但变化不大，因此选择盐酸体积分数为20%。

2.2 硼氢化钠质量浓度

硼氢化钠的质量浓度对结果影响显著，当硼氢化钠质量浓度较低时，氢化物反应不完全，结果偏低；当硼氢化钠质量浓度过高时，反应过于剧烈，产生大量氢气，火焰过高，也会使得结果异常。将硼氢化钠质量浓度分别设为10、15、20、25 g/L和30 g/L，结果如图5所示，硼氢化钠质量浓度从10 g/L增加到15 g/L时，各形态硒峰面积显著提升；当硼氢化钠质量浓度高于15 g/L后，到20 g/L时，虽然Se(IV)峰面积提升明显，SeCys2和SeMet的峰面积有提升趋势但变化不大，其他硒形态呈下降趋势；当硼氢化钠质量浓度高于20 g/L后，所有形态硒峰面积都处于下降趋势。因此根据物料和效率综合考虑选择硼氢化钠质量浓度为15 g/L。

2.3 碘化钾质量浓度

紫外消解系统先把有机硒氧化成Se(VI)，随后碘化钾把Se(VI)还原为Se(IV)，保证后续氢化物发生效率，因此碘化钾浓度是实验重要一环，将碘化钾质量浓度分别设为1.0、1.5、2.0、2.5 g/L和3.0 g/L，在碘化钾质量浓度小于2.5 g/L时，各形态硒峰面积有所波动但变化不大，当碘化钾质量浓度大于2.5 g/L时，没有明显提升和改善。因此选择碘化钾质量浓度为2.5 g/L。

3 前处理条件选择

3.1 不同处理方式和酶的选择

本研究对比了两种常用前处理方式：一种是恒温振荡为主，另一种是超声。超声处理凭借其独特的空化效应，能够促进酶与样品充分接触并加速反应，从而更高效地作用于样品。结果表明，采用恒温振荡法时，随着处理时间延长，有机硒的稳定性下降，易导致目标物损失。相比之下，超声处理对有机硒的损失影响较小，在适宜条件下其损失可忽略不计，且具有处理时间短、效率高的优势，是一种更为理想的前处理方式。

目前，硒形态分析中应用最广泛的前处理技术是蛋白酶提取法，与硝酸提取、盐酸提取或水提法相比，酶水解法具有显著优势：反应条件温和、能有效避免硒形态转化，且过程绿色环保。茶叶中的硒通常与蛋白质、核糖核酸等分子紧密结合，因此不易被破坏。不同种类的酶与茶叶样品的结合位点存在差异，这会对硒的提取率产生一定的影响。有研究表明，蛋白酶K与蛋白酶XIV是常用的两种酶制剂，单独使用或与纤维素酶协同使用。基于此，本研究系统考察蛋白酶K、蛋白酶XIV（单独使用、混合使用或与纤维素酶复配）对5 种目标硒形态提取效果的影响，如图6所示。蛋白酶K单独作用于茶叶时，5 种形态硒回收综合效果较好；蛋白酶XIV对SeCys2和SeMet两种有机硒形态有显著影响，使得两者回收率降至一半左右；在蛋白酶K+蛋白酶XIV、蛋白酶K+纤维素酶、蛋白酶XIV+纤维素酶和蛋白酶K+蛋白酶XIV+纤维素酶的作用下SeCys2有机硒形态回收率极低。因此蛋白酶K是本实验酶的最优选。

3.2 酶加入量和超声时间的影响

加酶量对硒形态的提取效率有较大影响，根据前人的研究，酶加入量大多不会超过20 mg，因此设置蛋白酶K加入量梯度为2、5、8、10、15 mg和20 mg。如图7a所示，当酶加入量大于5 mg时，Se(IV)的回收率会受到极大抑制，其他形态影响不大；当酶加入量为2 mg时，SeCys2回收率略低。因此综合考虑各形态硒回收率，酶加入量为5 mg时最佳。

超声时间意味着酶与茶叶样品的作用时间长短，超声时间一般不超过60 min，因此选择超声时间分别为10、20、30、40、50 min和60 min。如图7b所示，超声时间低于40 min时，SeCys2回收率偏低；超声时间高于40 min时，SeCys2回收率变化不大。故而选择超声时间为40 min。

4线性范围和检出限

以峰面积（I）为纵轴，质量浓度（C）为横轴，5 种形态硒曲线的线性范围为2～100 μg/L，在最佳仪器条件下测定的线性方程如表1所示，各形态硒的相关系数不低于0.999 4，检出限为0.08～0.28 μg/L，即样品质量为0.1 g，定容体积为5 mL时，方法检出限为0.004～0.014 mg/kg。

5精密度和加标回收率

为了验证方法的准确性和重复性，按照最终优化选择的条件，向某一茶叶样品中分别加入低、中、高浓度的5 种形态硒混合标准溶液连续测定6 次，计算回收率和相对标准偏差。如表2所示，测定结果的加标回收率为80.2%～108.0%，相对标准偏差为1.1%～8.2%，精密度较好，表明实验方法可满足测定要求。

6实际样品分析

采用优化后的方法对市售的7 个茶叶样品进行测定，其中一种产自贵州的富硒茶叶检测出了SeMet和Se(VI)，其含量分别为0.282 mg/kg和0.059 mg/kg，其余样品均未能检出。7 种样品中只有1 种茶叶检出，在采购时只有1 种有较为正规的报告，其余6 种均为产自富硒带的茶叶，产地为湖北恩施和湖南永顺等，均没有与富硒相关的执行标准标注，因此对于食品行业富硒茶管理应进一步规范，加大监管力度。

结 论

本研究对色谱柱、流动相、氢化物发生及前处理条件进行优化，采用酶解法提取并建立一种高效液相色谱-原子荧光光谱法快速测定茶叶中5 种硒形态，该方法将磷酸氢二铵+柠檬酸梯度体系用于PRP-X100离子交换色谱柱，使得5 种形态硒可在9 min内分离，线性相关系数均高于0.999 4，方法检出限为0.004～0.014 mg/kg，加标回收率为80.2%～108.0%，相对标准偏差不大于8.2%，满足方法要求。该方法操作简单、分离稳定、成本低、效率高，适合广泛应用。

作者简介

第一作者：

张文隽，主管技师，北京市海淀区疾病预防控制中心科员。工学硕士，研究生毕业于中国农业大学，此后入职北京市海淀区疾病预防控制中心工作至今，主要研究方向包括元素检测与分析、环境卫生和食品卫生等。曾以第一作者身份在《Insect Science》等杂志发表论文。

引文格式：

张文隽, 崔悦, 王旭阳. 高效液相色谱-原子荧光光谱法测定茶叶中硒形态[J]. 食品科学, 2026, 47(11): 348-354. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20251127-229.

ZHANG Wenjun, CUI Yue, WANG Xuyang. Determination of selenium species in tea by high performance liquid chromatography coupled to atomic fluorescence spectrometry[J]. Food Science, 2026, 47(11): 348-354. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20251127-229.

实习编辑：王雨婷；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄

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