Science丨铂类化疗：儿童肝脏中广泛而差异的诱变印记

撰文|易

部分化疗药物通过损伤 DNA 杀伤癌细胞，当细胞在损伤中存活而修复并不完美时， DNA 损伤会以突变的形式留存下来，留下药物特异性的突变印记。化疗诱变被认为是儿童肿瘤幸存者远期不良效应（如 第二原 发癌）的可能原因，这一人群需要在一生的时间内承受治疗相关后果的演变。铂类药物（ 顺铂与 卡铂）是诱变化疗药物的典型代表，也是儿童实体瘤治疗方案的核心骨架。铂类在成人正常组织中的诱变作用已有较充分的记录，但在儿童中的 情况 并不清楚 。 迄今规模最大的 2860 例儿童肿瘤幸存者血液研究未检出铂类信号，个别报告却发现过铂类诱变，这一矛盾可能源于常规测序技术的局限，即只有突变发生克隆扩增后才能被检出。此外，同一次全身性药物暴露是否会在不同组织中留下不同的突变，此前也完全未知。

近日，英国维康桑格 （ Wellcome Sanger ） 研究所Sam Behjati与弗朗西斯 · 克里克研究所Foad J. Rouhani合作，在 Science 期刊发表题为 Extensive and differential platinum chemotherapy mutagenesis in livers of children 的研究论文 ，以单DNA分子分辨率的双链测序（NanoSeq）系统描绘了铂类药物在儿童正常组织中的诱变图谱，发现铂类暴露将儿童组织的突变负荷提升至成人水平，并鉴定出一种仅出现于肝脏的新型铂类突变特征，同时证明化疗诱变在正常组织中产生大量具有潜在致病功能的变异。

研究首先以肝母细胞瘤患儿为切入点 ， 这类患儿术前通常接受 顺铂单 药或 联合卡铂治疗 ，部分患儿在治疗中接受全肝置换手术，使研究者能够在同一患儿体内系统取材多个解剖区域的正常肝、肿瘤与匹配血液。在发现队列（ 4 例经治与 2 例未治患儿的 93 份正常肝、 6 份血液及 23 份肝肿瘤样本）中，常规全基因组测序在正常肝与血液中平均仅检出 14 个替代突变，符合镶嵌变异的稀少预期；而全基因组 NanoSeq 显示出数 倍 的突变负荷升高，血液、正常肝与肝肿瘤分别升至未暴露组织的 9 倍、 12 倍与 5 倍，使铂类暴露儿童组织的突变负荷达到成人肝脏与血液的水平，暴露的正常肝样本平均携带约 2200 个替代突变，嵌入与双碱基替代负荷同样升高。

突变特征分析采用 mSigHdp 与 SigProfilerExtractor 两种相互独立的方法。已知铂类特征 SBS31 与 SBS35 遍在于所有暴露组织，而两种方法一致地从暴露的肝脏（正常肝与肝母细胞瘤）中提取出一种新的突变特征 SBSA ，血液中则没有。 SBSA 无法用 COSMIC 数据库已有特征或其他已发表的铂类特征解释，其特征性改变为 GCC 三核苷酸背景下的 C>A 、 C>G 与 C>T 突变，具有转录链偏倚，单一样本中最多可占替代突变的 92% （中位 46% ），且提取可靠性达 99% 。

为验证并扩展发现，研究 将靶向 NanoSeq 应用于 255 份组织样本（取自肝切除、 儿童尸体解剖与人胎儿肝脏），针对 285 个基因（绝大多数为癌症基因）共 检测约 11.5 万个二倍体细胞当量，鉴定出 75104 个变异。结果显示：铂类暴露使所有组织（肝、血液及肾上腺、肾、胰腺、脾、甲状腺、皮肤、心脏）的突变负荷升高；即使极短暴露也有效应，一名仅接受 单周期卡铂的 婴儿，正常组织替代突变数升至年龄相近的三个未暴露婴儿的 4 倍；暴露剂量与时长进一步推高负荷。 SBSA 在这一验证队列中再次仅见于暴露肝脏，而不见于血液与其他器官；接受 顺铂单 药或 联合卡铂的 患儿肝脏均出现 SBSA ，说明 顺铂单 药足以产生该特征；未使用耳保护剂硫代硫酸钠的患儿同样出现 SBSA ，排除了该药作为成因。一名仅 接受卡铂 的患儿经全基因组 NanoSeq 高分辨分析仅显示已发表的卡 铂 特征 SBS_Carboplatin ，而无 SBSA 。

随后从多个正交途径验证 SBSA 的真实性与肝脏倾向性。对外部数据的再分析涵盖 5 个队列、 1646 例肿瘤（至少 60 种类型）： 5 例经历 过铂类暴露的儿童肝肿瘤复发中 4 例携带 SBSA ，儿童肝肿瘤复发与转移的汇总编码突变中亦检出 SBSA ，而其他儿童癌症（包括未暴露肝肿瘤）与成人肝硬化肝脏中均无 SBSA 。体外实验中， 顺铂处理 的肝癌细胞系出现 SBSA （ 单用卡铂不 出现），单核细胞系与乳腺癌细胞系均不出现，说明肝细胞自身即可产生该特征。小鼠实验中， 顺铂与卡铂 暴露使各组织突变负荷平均升至 1.8 倍，已知铂类特征见于所有暴露组织，而 SBSA 仅在其中一只小鼠的肝脏被检出，与人体样本中的肝脏倾向一致。

此外， 靶向 NanoSeq 还回答了化疗诱变是否产生有功能后果的变异。在暴露的正常肝组织中，对 285 个基因检测了 108872 个 DNA 分子当量，发现 21714 个非同义变异，其中 1522 个位于癌症基因、符合肿瘤学意义上的潜在致病标准（如抑癌基因截断突变或癌基因热点突变）；暴露血液中则出现白血病相关变异，正常肝中出现肝母细胞瘤主要驱动基因 CTNNB1 的 3 号外显子热点突变。与非暴露组织相比，暴露组织的非同义变异与驱动变异显著富集，这一富集可由突变负荷升高解释（大基因更易受累），且大部分驱动变异可归因于 SBSA ；不过未检出任何特定癌症基因受到正选择的证据，提示这与末次暴露至取材间隔仅数周有关。

综上所述 ，本研究证明铂类化疗药物在儿童正常组织中造成广泛且具有组织差异性的诱变。同一次全身性暴露将儿童组织的突变负荷 推高 至成人水平，却只在肝脏留下区别于已知铂类特征的新印记 SBSA 。研究的局限包括体外验证使用的 HepG2 为癌细胞系 而非正常肝细胞 、在体验证动物数量少（暴露 2 只、对照 1 只），以及随访间隔短而无法评估选择效应。就意义而言，化疗诱变在暴露儿童正常组织中产生了海量的潜在致病变异，而 第二原 发癌与部分代谢性肝病正是由体细胞突变驱动的疾病，化疗诱变因而可能构成儿童肿瘤治疗远期不良效应的一个直接且可量化的成因，为幸存者的长期监测与治疗方案的诱变性评估提供了框架。

https://doi.org/10.1126/science.ady0339

制版人： 十一

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