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蛋白质主链酰胺键水解能垒高，从头设计蛋白酶长期存在技术瓶颈。2026年10月15日，华盛顿大学David Baker、Samuel J. Pellock 与 Donald Hilvert 团队完成题为 De novo design of cysteine proteases 的研究，他们依托 RFD2‑MI 扩散模型，搭建全新蛋白骨架，实现序列依赖性半胱氨酸蛋白酶的从头设计与实验验证。
研究团队一共测试 69 种计算设计产物，13 种展现出蛋白切割活性，设计成功率达到 19%，部分变体相较背景反应速率提升最高可达 3×10⁷倍，解析得到六套晶体结构，蛋白主链 Cα 均方根偏差小于 1.2 Å，设计得到的蛋白酶 TM 分数低于 0.5，和自然界已知蛋白酶的折叠架构存在明显区别。他们采用 β 链配对的策略固定肽段底物，催化核心保留天冬氨酸‑组氨酸‑半胱氨酸催化三联体和氧阴离子洞的功能元件，整套计算筛选流程依靠 RFD2‑MI、ProteinMPNN 与 AlphaFold3 完成多轮迭代过滤。
Dokki 系列变体经过位点突变组合优化后，最优突变体 Dokki‑v2 的催化效率得到大幅提升，它的 kcat/KM 达到 413 M⁻¹s⁻¹，对酰胺键的加速倍数可达 1.8×10⁹，蛋白熔解温度高于 80 ℃，在 70 ℃条件下依旧保留酶活，该变体可以特异性识别目标肽段序列，对其他相似序列底物几乎不产生切割效果。晶体结构与分子动力学模拟的结果显示，设计酶和天然蛋白酶仍存在活性差距，差距来源于活性中心预组织程度不足，还有底物在活性口袋中的定位精度受限的问题。
这套从头设计获得的蛋白酶可以在哺乳动物 HeLa 细胞内正常发挥切割功能，研究人员把蛋白酶与核定位信号进行融合，搭配荧光报告系统完成胞内活性检测，失活催化位点突变体不会触发底物的切割与荧光蛋白的胞内重分布。整套设计管线产出的全新蛋白酶骨架拓展了蛋白质结构空间，相关的序列、晶体坐标与分析代码全部公开，可为合成生物学、细胞工程以及治疗方向的工具酶开发，提供可复用的设计思路与实验素材。
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