FSHW | 锌结合肽通过膜破坏及群体感应干扰机制抑制铜绿假单胞菌活性

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Introduction

铜绿假单胞菌：无处不在的微生物与多重威胁

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种广泛存在于水、土壤、植物、动物和人类中的机会性病原体。虽然对健康个体威胁较小，但在医院环境中，它对免疫系统受损的患者构成严重威胁，可能引发肺炎、尿路感染、败血症等疾病。此外，铜绿假单胞菌也是水产养殖中的主要病原体，并导致水产品和食品（如肉类、乳制品）的腐败。值得注意的是，牛肉、羊肉、鸡肉等动物源性食品是其耐药基因的储存库，食用被污染的食品可能引发感染并传播耐药性，尤其对免疫力低下的人群危害更大。铜绿假单胞菌还能通过形成生物膜在多种表面定植，使其对抗菌剂的抵抗力远超浮游细胞，难以彻底清除。

生物膜：细菌的“保护盾”

生物膜是细菌附着在表面形成的微生物聚集体，外部包裹着多糖、蛋白质和核酸组成的保护性基质。它是细菌在自然、医疗和食品加工环境中的主要生存形式。超过80%的细菌感染与生物膜有关，约60%的食源性疾病暴发也源于此。生物膜内的细菌对传统抗生素和宿主免疫反应具有极强的抵抗力，其耐药性比浮游细菌高出千倍以上，成为根除细菌感染的重大挑战。

锌基抗菌材料：新兴的解决方案

近年来，锌基抗菌材料因其良好的生物相容性、广泛的温度稳定性以及易于保存和转移等优点，在各个领域受到了广泛关注。其中，纳米氧化锌（ZnO）在多个领域展现出杀菌作用。然而，纳米级氧化锌的沉淀和聚集已被证明对健康细胞有害，且过量使用锌可能会产生不良影响，加之生产成本较高，限制了其应用。作为一种弱电解质，锌纳米复合物提供了一种有效控制介质中Zn²⁺剂量的方案。因此，锌纳米复合物作为抗菌剂引发了广泛关注，例如L-苯丙氨酸氧化淀粉配位锌、席夫碱配位锌和1,4-苯二氧基二乙酸配位锌。

食品源锌螯合肽：低成本且高效的抗菌选择

近年来，食品源水解抗菌锌螯合肽因其低生产成本和稳定的性质受到了研究者的广泛关注。富含蛋白质的食品加工废弃物，如鱼鳞、软骨和皮，可能是抗菌锌结合肽的优质来源。然而，大量的鱼鳞通常被作为低价值废弃物丢弃，这无疑是对海洋资源的低效利用，甚至污染了生态环境，阻碍了渔业的可持续发展。鉴于成本效益和环保性，本研究以红鲷鱼鳞为原料，通过酶解法制备了富含锌结合位点的配体肽CSSP。充分利用废弃鱼鳞回收螯合剂CSSP，是将废物转化为宝的重要尝试，但其作为制备抗菌锌结合肽CSSP-Zn的配体以控制病原菌定植的应用仍鲜有探索。

福州大学生物学与工程学院汪少芸教授团队利用鱼鳞源锌螯合肽CSSP-Zn，研究了其对铜绿假单胞菌PAO1抗菌和抗群体感应机制，并在草鱼模型中验证了其原位抗菌效果，为食源性病原菌的生物防治提供了新思路。

Graphical abstract

Results and Discussion

肽锌螯合机制分析

CSSP与Zn²⁺配位后，在结构和性质上均发生显著变化。荧光光谱显示，CSSP的荧光峰值约为310 nm，主要来自酪氨酸残基，而与Zn²⁺结合后，CSSP-Zn的荧光强度从9 207降至4 089，最大吸收带发生偏移，表明Zn²⁺与CSSP中的氨基、羰基和羟基发生螯合，导致荧光猝灭效应。热稳定性分析进一步揭示，CSSP-Zn的吸热峰向高温方向移动（106.91、262.47、325.34 °C），质量损失从70.18%降至34.33%，表明其结构更稳定（图1B）。微观结构上，CSSP呈现絮状结构（>1 μm），而CSSP-Zn则形成纳米级颗粒状聚集体，这归因于Zn²⁺与CSSP的羧基和氨基形成“盐桥”，并中和了CSSP的负电荷，使颗粒更紧密。这些规律表明，Zn²⁺的引入显著提升了CSSP的光学性能、热稳定性和结构致密性，为其在抗菌材料中的应用提供了重要依据。

图1. CSSP和CSSP-Zn的性质和形态表征。（A）荧光光谱。（B）热重-差示扫描量热（TG-DSC）分析（B1：TG，B2：DSC）。（C）扫描电子显微镜（SEM）检测。

CSSP-Zn抗菌活性评估

CSSP-Zn对铜绿假单胞菌PAO1展现出强大的抗菌活性。通过氧化还原实验，CSSP-Zn在0.23 mg/mL浓度下表现出抑制活性（MIC）（图S1A），并在1.84 mg/mL浓度下完全杀灭病原菌（MBC）（图S1B），其抗菌效果优于或接近多种已知抗菌材料，如Cu/Zn-碳微纳米纤维-聚合物纳米复合材料（MIC=4 mg/mL）和岩藻聚糖稳定的金纳米颗粒（MIC=0.51 mg/mL）。杀菌动力学实验进一步表明，CSSP-Zn显著降低了PAO1菌株的存活数量，且具有时间和浓度依赖性（图S1C）。琼脂扩散结果表明，CSSP-Zn的抑菌能力明显强于无机锌（goslarite）（图S1D）。

图S1. CSSP-Zn的抗菌性能。(A) 最低抑菌浓度（MIC）值。(B) 最低杀菌浓度（MBC）值。(C) 时间-杀菌曲线。(D) 琼脂盘扩散试验。

CSSP-Zn对菌株2512的抗菌机制

透射电镜（TEM）显示，CSSP-Zn以剂量依赖方式破坏铜绿假单胞菌（PAO1）细胞结构，导致细胞质收缩、膜完整性丧失，甚至内容物外溢。NPN摄取实验表明，CSSP-Zn显著提高外膜（OM）通透性，MBC浓度下OM通透性达62.93%，是对照组的44.63 倍。同时，CSSP-Zn还破坏内膜（IM），导致β-半乳糖苷酶外泄，邻硝基苯酚吸光度值显著升高。DPH荧光实验进一步证实，CSSP-Zn降低膜流动性，MBC浓度下荧光强度达9.62 × 10⁷，远高于对照组（4.12 × 10⁷）。此外，CSSP-Zn抑制Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶活性，导致细胞内Ca²⁺水平升高，引发活性氧爆发和细胞稳态失衡。DiSC3-5和BCECF-AM探针实验表明，CSSP-Zn通过破坏质子动力势（PMF）引起膜去极化和ΔpH崩溃，显著降低细菌呼吸水平（图3D-F）。

图2. CSSP-Zn处理对菌株PAO1形态的影响。（A）浮游细胞。（B）生物膜细胞。（C）脂质对胞外聚合物（EPS）的影响。

图3. CSSP-Zn对细菌膜的影响。（A）膜通透性。（B）膜完整性和流动性。（C）Ca2+-Mg2+-ATP酶活性和Ca2+相对水平。（D）Δψ。（E）ΔpH。（F）细菌呼吸。

CSSP-Zn对菌株2512的抗群体感应机制

锌螯合肽CSSP-Zn通过显著抑制铜绿假单胞菌（PAO1）的毒力因子（如绿脓菌素、鼠李糖脂、铁载体和蛋白酶）削弱其生物膜形成能力。与对照组相比，MIC和MBC组的绿脓菌素产量分别减少38.02%和47.37%，鼠李糖脂产量降低29.22%和54.47%，蛋白酶活性下降58.52%和66.75%（图5A-C）。CSSP-Zn还通过降低PAO1的表面疏水性（MIC组60.01%，MBC组20.99%）和初始附着率（减少79.33%和85.58%），有效抑制生物膜的早期形成（图5D）。在生物膜消除方面，CSSP-Zn显著降低生物膜指数（BFI），MIC和MBC组分别减少53.85%和68.38%，并对预形成生物膜的残留率控制在61.41%和35.35%（图5E）。显微观察显示，CSSP-Zn破坏生物膜拓扑结构，导致细胞分散和EPS结构改变，进一步削弱生物膜稳定性（图2B-C）。此外，CSSP-Zn通过下调QS系统关键基因（如lasI、lasR、rhll、rhlR和pqsR）的表达，抑制毒力因子合成和生物膜成熟（图6）。

图5. CSSP-Zn对毒力产生的影响。（A）绿脓菌素和鼠李糖脂活性。（B）绿脓杆菌素活性。（C）蛋白酶产生。（D）初始粘附和表面疏水性。（E）生物膜形成和消除。

图6 CSSP-Zn对QS途径基因表达的影响

CSSP-Zn对菌株2512的原位抗菌作用

研究发现，锌螯合肽CSSP-Zn在草鱼模型中显著抑制铜绿假单胞菌（PAO1）的生长和毒力因子分泌。对照组中，PAO1菌株数量从第0天的5.01 lg (CFU/g)增至第7天的8.66 lg (CFU/g)，而MBC组未观察到明显增加（图7A）。此外，CSSP-Zn处理有效阻止了PAO1产生的绿脓菌素导致的鱼体变绿和异味，展现了其在生物防治中的潜力（图7B）。

Conclusion

本研究成功通过CSSP的氨基氮和羧基氧原子与Zn²⁺配位合成了CSSP-Zn。CSSP-Zn通过破坏膜完整性、扰乱膜功能基因调控，导致膜功能损伤和代谢紊乱，展现出强大的抗菌效果。此外，CSSP-Zn通过降解EPS抑制生物膜形成并分散成熟生物膜，同时下调QS基因表达，减少毒力因子的产生。在鱼类模型中，CSSP-Zn有效抑制了铜绿假单胞菌（PAO1）的生长和毒力因子分泌。CSSP-Zn的制备不仅为鱼鳞废弃物的高值化利用提供了可持续途径，还有助于缓解资源危机、减少环境污染，并为绿色生物防治剂的开发提供了新思路。

通信作者简介

汪少芸，女，美国威斯康星大学和美国加州大学戴维斯分校博士后，现担任二级教授、博士生导师，福州大学生物科学与工程学院院长，福州大学海洋科学与技术研究院院长。入选全国“三八”红旗手、国家“万人计划”科技创新领军人才、国务院特殊津贴专家、科技部中青年科技创新领军人才、省A类高层次人才、省高层次创新人才、省科技创新领军人才。担任国家“一流专业”负责人、“生物与医药”博士点负责人、省协同创新中心主任、省工程研究中心主任。兼任《Food Biomacromolecules》主编，《Food Frontiers》副主编，《Food Science of Animal Products》科学主编，《Food Science and Human Wellness》、《Journal of Future Foods》、《食品科学》、《食品工业科技》和《福州大学学报》（自然科学版）编委，《中外食品技术》首批翻译专家。主持承担省部级以上及横向重大重点项目40余项，编写著作8 部，获授权发明专利79 件，发表SCI/EI收录学术论文230篇，多篇论文获中国食品学会创新科技论文一等奖和福建省自然科学优秀论文一等奖，入选Elsevier全球前2%顶尖科学家榜单。主持成果获国际食品功能因子（ICOFF）学术大会奖、中国轻工业联合会科技进步一等奖、中国石油和化工联合会科技进步一等奖、中国产学研合作创新成果一等奖、中国食品工业协会科技进步一等奖、中国食品产学研优秀科研成果一等奖、福建省科技进步一等奖、福建省自然科学二等奖、福建省科技进步二等奖（排名均第1）；获紫金科技创新奖、厦航奖教金奖；获评宝钢优秀教师、卢嘉锡优秀导师、中国食品科技学会科技创新-杰出青年、省优秀教师、省最美科技特派员、省优秀科技工作者。

Zinc-binding peptides inactivate Pseudomonas aeruginosa via disrupting membrane and interfering with quorum-sensing

Shuhua Lin, Shuhong Zheng, Yanquan Chen, Xixi Cai, Shaoyun Wang*

College of Chemical Engineering; College of Biological Science and Engineering, Fuzhou University, Fuzhou 350108, China

*Corresponding author.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa, recognized for its biofilm production and secretion of virulence factors, posing a severe threat in areas such as clinical infections, food contamination, and marine biofouling. To address this, a new type of zinc-binding peptide (CSSP-Zn) was prepared from crimson snapper scales peptides (CSSP) and goslarite, and its antibacterial and anti-quorum-sensing activities toward P. aeruginosa PAO1 were exploited. Results indicated that CSSP-Zn induced planktonic strain PAO1 membrane injury via inhibiting expression levels of cell integrity genes, targeting microbial-specific membrane constituents, disrupting proton motive force, and causing metabolic disturbances. Meanwhile, CSSP-Zn decreased virulence factors pyocyanin, protease and rhamnolipid secretion, while considerably inhibiting quorum sensing-related genes (las, pqs and rhl) expression and decreasing bacterial abundance and pathogenicity in fish models. Moreover, CSSP-Zn not only effectively hindered biofilm formation but also disassembled preformed ones, thus disrupting biofilm topology. Taken together, utilizing food byproducts to obtain CSSP-Zn could help recycle food resources and provide insight into controlling planktonic and biofilm strain PAO1 contamination.

Reference:

LIN S H, ZHENG S H, CHEN Y Q, et al. Zinc-binding peptides inactivate Pseudomonas aeruginosa via disrupting membrane and interfering with quorum-sensing[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(9): 9250315. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250315.

本文编译内容由作者提供

编辑：王佳红；责任编辑：孙勇

封面图片：图虫创意

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