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光酶重编程亚胺还原酶实现P中心自由基立体发散氢膦酰化

手性有机磷化合物在农药、医药、材料和不对称催化中具有重要价值。传统合成多依赖外消旋体拆分和化学计量手性辅剂；不对称催化虽已发展出去对称化、P(O)-H不对称烷基化/烯基化/芳基化及动力学拆分等策略，但P中心自由基因非平面几何和低锥形反转能垒，立体控制长期困难。已有工作主要实现C-立体有机磷化合物的自由基合成，而从外消旋膦氧化物出发，构建P-立体或C/P-双立体中心的选择性自由基转化仍未见报道；天然C-P成键酶也十分稀缺。烟酰胺依赖酶的光引发非天然反应虽具潜力，但不同引发模式和自由基物种仍待探索（图1c、图1d、图1e）。

鉴于此，浙江大学吴起教授、徐维华博士与上海交通大学丁蓓教授，杭州师范大学王治国副研究员提出一种光酶催化的立体发散氢膦酰化策略：将烟酰胺依赖亚胺还原酶（IRED）重编程为不对称氢膦酰化酶（AHP）。在该体系中，光激发NADP在IRED活性位点经单电子氧化二级膦氧化物（SPO）生成P中心自由基，并以氧化还原中性方式完成立体选择性C-P偶联。我们通过聚焦定点进化获得立体发散突变体，制备了含C-、P-或C/P-双立体中心的三级膦氧化物。机理研究揭示了一条此前未报道的、由光激发NADP引发底物单电子氧化的反应途径；结合酶活性口袋的精确改造，实现了对P中心自由基及C/P-双中心自由基中间体的发散立体控制。相关论文以为“Photoenzymatic stereodivergent hydrophosphinylation enabled by nicotinamide-dependent imine reductases”发表在最新一期《nature catalysis》上。

图 1 | 光酶催化的磷中心自由基立体可逆加氢膦反应

反应优化与C-立体TPO的定向进化及底物范围

研究先从模型反应入手：二苯基膦氧化物（1a）与α-甲基苯乙烯（2a）反应，构建一个C-立体中心。筛选野生型氧化还原酶时，IR14表现最好，给出>99% e.e.的(R)-3a（图2b，entry 1）。纯酶条件下3a产率18%、e.e.仍>99%；游离NAD(P)只得到痕量外消旋产物；BL21(DE3)细胞或游离NADPH没有目标产物；光照和厌氧环境都不可缺少。优化pH、光波长和1a:2a比例后，产率提高到80%，e.e.保持>99%；酶载量可降到0.1 mol%，TTN达277且e.e.不降，说明AHP1确实能催化这一转化。随后，研究者基于AHP1结构对接，锁定L173、M176、V231、H237、R239和T240等可能影响立体选择性的残基。M176L给出89%产率、70% e.e.的(S)-选择性；T240F给出88%产率、71% e.e.；以T240F为模板继续迭代饱和突变，得到M1761/T240F（AHP2），产率75%、>99% e.e.的(S)-选择性（图2d）。这样，AHP1和AHP2就成为一对立体互补催化剂，可分别得到C-立体三级膦氧化物的两种对映体，并对多种对称二芳基膦氧化物有较好耐受性（图2e）。

图 2 | 用于光酶合成C-立体中心TPO的反应开发

P-立体与C/P-双立体TPO的光酶合成

在P-立体产物合成中，外消旋SPO 4与烯烃5反应时，野生型AHP1倾向(S)-选择性，给出63%产率、>99% e.e.；I122F/W177A（AHP3）则反转为(R)-选择性，给出65%产率、97% e.e.（图3b）。P-立体产物6a–6i的产率在19–72%之间，e.e.可达>99%（图3c）。到了更难的同时控制C和P两个中心的C/P-双立体合成，AHP4（I122A/T240F）达到157 TTN、>99% e.e.、>99% d.e.；T240F为31 TTN、94% e.e.、54% d.e.，野生型低于1 TTN（图3e）。产物7a–7h产率21–68%，>99% e.e.，d.e.为91–99%（图3f）。标准条件为：外消旋SPO 4 0.016 mmol、烯烃5或2 0.004 mmol、酶1 mol%、2.4 mL 20 mM Tris-HCl缓冲液（pH 9.0）、DMSO 10 v/v%、甘油10 v/v%、25 °C、24 h、N₂、365 nm 20 W LED。整体上，该平台制备了78例含C-、P-或C/P-双立体中心的手性有机磷产物，最高>99% e.e.和d.e.。

图 3 | P-手性和C/P-双手性TPO的光酶合成

机理研究

机理研究把这条“光—酶—自由基”的路径串了起来。催化循环中，AHP1、NADP⁺与1a先形成EDA复合物，光激发后发生单电子转移（SET），生成P自由基Int-III；随后自由基加成得到Int-IV，再经氢原子转移（HAT）生成3a并再生NADP⁺（图4a）。荧光淬灭、UV-vis、瞬态吸收和EPR（DMPO捕获）等结果都支持这一路径：NADP⁺态AHP1与1a的荧光淬灭更快，激发态氧化电位为+3.05 V vs SCE，足以氧化1a/Int-I（Eₒₓ≈+1.0 V vs SCE）。NADP⁺/1a与AHP1/1a的EADS相似，时间常数分别为2.4/40 ps和11/116 ps（图4d）。自由基捕获得到9，自由基钟实验得到11，α-CF₃苯乙烯给出13（22%）和14（3%），支持HAT终止（图4f–h）。氘代缓冲液给出73%氘掺入，氘代缓冲液加D-1a达>99%，KIE支持HAT限速（图4i）。

图 4 | 机制研究

计算研究

计算方面，QM/MM显示AHP1和AHP3中P自由基生成均无能垒，反应按P-C偶联后HAT两阶段进行；AHP3催化(R)-6a的能垒为4.01和8.91 kcal mol⁻¹，(S)-6a为无能垒偶联加7.50 kcal mol⁻¹ HAT（图5a、图5b）。MD还表明，AHP1通过L15、I122、L173、M176、W177、W214、H237稳定4a的对叔丁基苄基水平构象；AHP3的I122F/W177A扩大内腔，使叔丁基苯基垂直并与F122发生π-π堆积。P自由基异构体互变能仅1.7 kcal mol⁻¹；AHP4中溴苯基与F240的π-π堆积使7a达>99% e.e.、>99% d.e.。可见立体选择性主要来自突变口袋的结构框架，动力学过程起精修作用。

图 5 | 计算研究

总结与展望

总的来说，这项工作把天然催化二电子亚胺还原的IRED改造成光酶AHP，实现了氧化还原中性、立体可控的C-P成键，为P中心及C/P-双中心自由基的立体控制提供了可进化、可拓展的酶催化平台。它扩展了光生物催化的C-P成键反应谱，也让长期困扰自由基磷化学的立体控制问题多了一条绿色、可编程的解决路径。