Phytomedicine (1区Top)｜蓝桉果实提取物靶向IRE1α/XBP1s轴改善MASLD：活性成分MA首次锁定IRE1α h1口袋！(孔令义...

2026年6月，中国药科大学天然药物全国重点实验室/江苏省活性天然产物研究重点实验室、中药学院孔令义、杨明华团队等，在Phytomedicine（中科院1区Top，2024 Journal Impact Factor=8.3）发表题为 “Eucalyptus globulus fruit extract alleviates MASLD via modulation of the IRE1α/XBP1s pathway” 的研究论文。该文于2026年4月7日投稿，2026年5月20日修回，2026年6月2日接收，目前为 Journal Pre-proof 版本。

该研究聚焦蓝桉果实提取物（EgE）在代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）中的潜在干预作用。研究发现，EgE 不仅能在游离脂肪酸（FFA）诱导的肝细胞脂肪变性模型中显著降低脂质积累，还能在高脂饮食（HFD）和蛋氨酸-胆碱缺乏饮食（MCD）诱导的两种 MASLD 小鼠模型中改善糖脂代谢紊乱、减轻肝脏脂肪变性及相关病理性肝损伤。

机制上，研究者通过转录组学、DARTS、通路抑制/敲低实验和分子对接等方法发现，EgE 可激活适应性 IRE1α/XBP1s 信号轴，进而调控肝脏糖异生、脂质生成和脂质分泌相关转录谱，并抑制病理性内质网应激。进一步研究鉴定出 Macrocarpal A（MA） 是 EgE 的主要活性成分，可结合 IRE1α 的 h1 口袋，增加 IRE1α 二聚体水平，上调 XBP1s，从而介导降脂作用。作者认为，MA 是首个被报道可结合 IRE1α h1 二聚化口袋的天然 IRE1α 激活剂，为 MASLD 的植物来源候选干预策略提供了新的实验依据。

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【摘要】

背景：代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）的发病率持续升高，但可用的药物治疗选择仍然有限。蓝桉（Eucalyptus globulus）果实是一种具有经验性调脂作用的草药，但其针对 MASLD 的治疗潜力尚未得到系统研究。

目的：本研究旨在评估蓝桉果实提取物（E. globulus fruit extract，EgE）抗 MASLD 的作用，鉴定其主要活性成分，并阐明潜在作用机制。

方法：研究首先在游离脂肪酸（free fatty acid，FFA）刺激的肝细胞中评价 EgE 的降脂活性，随后在两种 MASLD 小鼠模型中评估其治疗作用。研究者进一步通过植物化学分析鉴定 EgE 的主要成分，并结合转录组学、药物亲和反应靶标稳定性实验（drug affinity responsive target stability，DARTS）、通路抑制/敲低实验、分子对接等方法探究其作用机制。

结果：EgE 可显著降低 FFA 诱导的体外脂质含量升高。在体内实验中，EgE 明显改善糖脂代谢紊乱，减轻肝脏脂肪变性，并缓解相关病理性肝损伤。肝脏转录组分析显示，脂质代谢和内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）相关通路显著富集。进一步机制研究表明，EgE 是 IRE1α 调节剂，可激活适应性 IRE1α/XBP1s 信号，从而抑制病理性 ERS。Macrocarpal A（MA）被鉴定为主要活性成分。MA 可结合 IRE1α 的 h1 口袋，增加其二聚体形式，提高 XBP1s 水平，并发挥降脂作用。

结论：EgE 通过激活适应性 IRE1α/XBP1s 轴表现出显著抗 MASLD 作用，具有作为 MASLD 管理新型候选药物的潜力。其主要成分 MA 可直接作用于 IRE1α 的 h1 口袋并增加二聚体 IRE1α，这是一种此前未被认识到的结合模式。

01

研究背景及科学问题

代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）主要由肝细胞脂质稳态失衡驱动。未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）是调控肝脏脂质代谢平衡的核心适应性信号通路。作为进化上最保守的跨膜 UPR 感受器，肌醇需求酶 1α（inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α）已成为代谢性肝病领域的重要研究靶点。IRE1α 可协调下游信号级联，抑制异常肝脂质沉积，并维持正常脂蛋白分泌。因此，靶向调控 IRE1α 信号有望纠正肝脏脂质代谢紊乱并改善后续肝损伤，是 MASLD 治疗中颇具潜力的策略。

IRE1α 具有双重酶活性，既是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，也是一种内切核糖核酸酶（RNase）。IRE1α 激酶结构域发生反式自磷酸化后，可促进核苷酸与激酶口袋结合，从而推动 IRE1α 形成具有催化活性的背靠背二聚体构象，并进一步激活其 RNase 结构域。被激活的 IRE1α RNase 主要通过两种经典下游机制调控细胞适应性稳态和命运决定：其一，对 XBP1 mRNA 进行位点特异性剪切，生成具有转录活性的剪接型异构体 XBP1s；其二，通过 IRE1 依赖性调控性降解（regulated IRE1-dependent decay，RIDD）选择性降解含有 XBP1 样茎环结构的 mRNA。

IRE1α/XBP1s 通路是抵御肝脏脂肪变性的关键适应性机制。肝脏特异性敲除 Xbp1 会导致全身代谢紊乱并促进肝脂肪变性；相反，在肥胖动物模型中过表达 XBP1s 可显著缓解脂肪性肝病严重程度。XBP1s 能广泛调节肝脏胰岛素敏感性、脂质生成、脂肪酸氧化以及脂蛋白分泌，从而维持肝脏脂质稳态。

然而，当代谢应激超过 IRE1α/XBP1s 信号轴的适应能力时，持续性 ERS 会诱导 IRE1α 活性发生病理性转变。在生理状态下，基础 RIDD 活性持续存在并发挥有益的稳态维持作用；但在病理状态下，异常 RIDD 活性会超出其经典靶标范围，广泛降解编码促存活因子以及特定 microRNA 前体的转录本，从而触发促凋亡信号输出，加重肝细胞损伤和肝功能障碍。值得注意的是，选择性 IRE1α/XBP1s 激活剂 IXA4 的相关研究显示，在不同时诱导 RIDD 或其他病理性 ERS 反应的情况下，靶向激活该通路可有效改善肥胖相关的全身脂质代谢紊乱。这提示药理学调控 IRE1α/XBP1s 轴在 MASLD 治疗中具有重要潜力。

蓝桉（Eucalyptus globulus，桃金娘科）广泛种植于中国西南地区。其果实俗称“一口钟”，长期用于传统临床实践，被认为具有祛风除湿、清热解毒、止咳平喘等作用。药用时，蓝桉果实通常以水煎、酒浸或外用方式使用。植物化学研究发现，蓝桉果实的主要活性成分包括甲酰间苯三酚杂萜类化合物（formyl phloroglucinol meroterpenoids，FPMs）、黄酮类、三萜类和挥发油。其中，FPMs 是主要富集于桉属植物中的特征性成分，并具有较强药理活性。

随着现代生活方式发生深刻变化，具有调脂能力的天然植物资源受到越来越多药理学研究关注。已有研究提示，蓝桉叶具有减重作用；在中国民间实践中，蓝桉果实也被用作降脂草本茶。来自哥伦比亚和秘鲁的民族药理学调查同样支持蓝桉果实具有经验性调脂和抗糖尿病作用。然而，介导这些调脂作用的活性成分以及其分子机制仍不清楚。此外，蓝桉果实针对 MASLD 的治疗潜力尚未被系统探索。

本研究证明，EgE 可通过激活 IRE1α/XBP1s 通路，抑制肝脏糖异生和脂质生成关键基因表达，并促进肝细胞脂质外排，从而重塑肝脏脂质代谢并显著改善 MASLD。值得关注的是，EgE 的主要活性成分 MA 可能与人源 IRE1α 的 h1 口袋结合，增加 IRE1α 二聚体形式，并进一步促进下游 XBP1 mRNA 剪接，改善脂质代谢。总体而言，本研究加深了对蓝桉果实药理作用的认识，并为开发 MASLD 新型治疗候选物提供了基础。

02

重要发现及亮点

EgE 减轻 FFA 诱导的肝细胞脂质积累

研究者首先在 AML12 和 HepG2 肝细胞中构建 FFA 诱导的肝脂肪变性细胞模型，用于评价 EgE 的降脂作用。CCK-8 结果显示，EgE 浓度不超过 20 μg/mL 时，对两种细胞均无明显细胞毒性。随后，研究者用 0.5 mM FFA 处理细胞 24 h 诱导脂肪变性，再给予 2.5、5 和 10 μg/mL EgE 干预 16 h，并以瑞舒伐他汀（rosuvastatin，Rsv）作为阳性对照。

BODIPY 493/503 染色显示，EgE 可剂量依赖性减少细胞内脂滴积累。定量分析进一步表明，与仅 FFA 处理的模型组相比，10 μg/mL EgE 可使 HepG2 细胞脂质含量降低约 37%，使 AML12 细胞脂质含量降低约 28%。同时，EgE 还可剂量依赖性降低两种细胞内总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）水平；在 10 μg/mL 时，EgE 使 HepG2 和 AML12 细胞内 TC 水平均降低超过 20%，TG 水平均降低超过 30%。这些结果说明，EgE 能有效缓解 FFA 诱导的肝细胞脂质积累。

图1：EgE 减轻 FFA 暴露肝细胞中的脂肪变性。（A）采用 CCK-8 实验检测人 HepG2 细胞和小鼠 AML12 肝细胞在不同浓度 EgE 处理后的细胞活力。（B-C）FFA 诱导的 HepG2 和 AML12 细胞在有无 EgE 干预条件下的代表性 BODIPY 染色图像（比例尺，200 μm）（B），以及 BODIPY 阳性脂滴面积的定量分析（C）。（D）FFA 诱导的 HepG2 和 AML12 细胞在有无 EgE 处理条件下的细胞内 TC 和 TG 含量。数据以 3 次独立生物学重复的均值 ± SD 表示。## < 0.001，与对照组相比；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，与仅 FFA 处理组相比。

EgE 改善 HFD 诱导 MASLD 小鼠的脂质代谢紊乱

在进入疗效评价前，研究者首先进行了 EgE 急性毒性评估。小鼠单次灌胃 200 mg/kg EgE 后，在 7 天观察期内未出现死亡、行为异常或主要器官组织病理学改变。随后，研究者采用高脂饮食（high-fat diet，HFD）喂养 C57BL/6 小鼠 8 周，建立 MASLD 模型。建模成功后，小鼠分别接受 10、20 或 40 mg/kg EgE 每日灌胃干预 4 周，并以临床已批准的降脂中成药血脂康（XZK）作为阳性对照。

HFD 组小鼠体重增长明显高于普通饮食（ND）组，而 EgE 处理组终末体重与 HFD 对照组相近。但 EgE 和血脂康均显著降低 HFD 诱导升高的绝对肝重和附睾白色脂肪组织（eWAT）质量，且 EgE 的作用具有剂量依赖性。40 mg/kg EgE 组的肝重/体重比相比 HFD 组下降约 26%。

血清生化结果显示，EgE 可剂量依赖性改善 HFD 诱导的高甘油三酯血症和高胆固醇血症。40 mg/kg EgE 可使血清 TC 和 TG 部分恢复至接近 ND 组水平，其作用较血脂康组更明显。EgE 还可剂量依赖性降低血清低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）并升高高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）。在肝损伤方面，HFD 显著升高血清 ALT 和 AST 水平，而 EgE 可剂量依赖性减轻这一升高，提示其对 HFD 诱导的肝损伤具有保护作用。

此外，EgE 还能改善葡萄糖稳态。4 周 EgE 给药可剂量依赖性降低空腹血糖；口服葡萄糖耐量试验（OGTT）显示，EgE 组全身葡萄糖清除能力明显改善。40 mg/kg EgE 组 OGTT 曲线下面积（AUC）较 HFD 组降低约 25%，且效果优于血脂康组，提示胰岛素敏感性可能得到改善。

肝脏层面的检测进一步支持 EgE 的保护作用。EgE 显著降低肝脏 TC 和 TG 水平，其中 40 mg/kg EgE 可使肝脏 TG 含量较 HFD 对照组降低约 40%。油红 O 染色显示，EgE 处理后肝脏脂滴积累呈剂量依赖性减少；H&E 染色也显示，EgE 明显缓解 HFD 诱导的严重脂肪变性。40 mg/kg EgE 组肝细胞空泡化减少最为明显，效果显著优于血脂康组。qRT-PCR 分析还显示，EgE 可剂量依赖性下调肝脏促炎细胞因子 Tnf-α、Il-6 和 Il-1β 的 mRNA 表达。

总体来看，EgE 能有效减轻肝脏脂肪变性，减少后续组织病理性肝损伤和伴随的肝脏炎症反应，从而阻碍 MASLD 进展。

图2：EgE 减轻 HFD 诱导 MASLD 小鼠的肝脂肪变性（每组 n = 6 只小鼠）。（A）HFD 诱导 MASLD 小鼠中 EgE 灌胃给药方案示意图。（B）各组小鼠肝指数（肝重/体重比）和附睾脂肪指数。（C）血清 TC 和 TG 水平。（D）血清 AST 和 ALT 水平，用于反映肝细胞损伤程度。（E-F）空腹血糖（E）和口服葡萄糖耐量试验（F），用于评估葡萄糖稳态和全身葡萄糖清除能力。（G）肝脏 TG 和 TC 水平，用于反映肝内脂质积累。（H-I）小鼠肝脏代表性大体图像以及典型肝组织切片染色图像，包括油红 O 染色（比例尺，500 μm）和 H&E 染色（比例尺，250 μm）（H），以及对应的肝脏脂肪空泡面积和油红 O 阳性脂滴面积定量分析（I），证实 EgE 可剂量依赖性减轻肝脂肪变性。数据以均值 ± SD 表示。## < 0.001，与对照组相比；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，与 HFD 组相比。

EgE 改善 MCD 饮食诱导的 MASLD 小鼠肝脏病变

为进一步评价 EgE 对更进展阶段 MASLD 的干预潜力，研究者采用蛋氨酸-胆碱缺乏饮食（methionine-choline deficient diet，MCD）建立小鼠模型。雄性 C57BL/6 小鼠经 MCD 饮食喂养 4 周后，接受 20 或 40 mg/kg/day EgE 每日灌胃干预 4 周，并以 20 mg/kg/day 奥贝胆酸（obeticholic acid，OCA）作为阳性对照。

EgE 可剂量依赖性减轻 MCD 饮食诱导的体重下降，并显著降低升高的肝脏重量，提示其对系统代谢稳态具有一定改善作用。肝脏脂质分析显示，40 mg/kg/day EgE 可使肝脏 TG 含量降低 43.8 ± 7.1%，降幅较 OCA 的 29.8 ± 10.8% 更明显。值得注意的是，EgE 和 OCA 对肝脏 TC 水平均仅表现出轻度抑制作用。

MCD 饮食导致血清 TC 和 TG 浓度明显下降，反映肝脏脂质分泌和输出受损；EgE 则可剂量依赖性恢复这些循环脂质参数。同时，EgE 显著降低血清 ALT 和 AST 水平，效果与 OCA 相当，并在数值上略优于 OCA，提示其可有效保护肝脏免受损伤。此外，MCD 饮食显著削弱肝脏抗氧化能力，表现为血清 SOD 活性降低、MDA 含量升高；EgE 可剂量依赖性逆转这些改变，提高 SOD 活性并降低 MDA 水平。

组织病理学和分子分析进一步验证了 EgE 的肝脏保护作用。H&E 和油红 O 染色显示，EgE 可剂量依赖性减轻肝脏脂质空泡化和脂肪变性。Masson 三色染色和 Sirius Red 染色进一步显示，EgE 显著减少胶原沉积并延缓肝纤维化进展。基于 NAFLD 活动评分（NAS）的定量分析显示，相同剂量下 EgE 所达到的病理改善程度与 OCA 相当。qRT-PCR 结果显示，与 MCD 对照组相比，EgE 明显抑制肝脏促炎基因 Tnf-α、Adgre1、Ccl2 以及促纤维化基因 Acta2、Col1a1、Cxcl10、Tgfb1 的 mRNA 表达。

结合 HFD 模型结果可见，EgE 在不同诱导方式的 MASLD 小鼠模型中均表现出显著干预作用。

图3：EgE 改善 MCD 诱导 MASLD 小鼠的肝脂肪变性、炎症和纤维化（每组 n = 6 只小鼠）。（A）MCD 饮食诱导 MASLD 小鼠中 EgE 灌胃给药方案示意图。（B）各组小鼠体重和肝重。（C）肝脏 TG 和 TC 含量，用于反映肝内脂质积累。（D）血清 ALT 和 AST 水平，用于反映肝细胞损伤程度。（E-F）小鼠肝脏代表性大体图像和组织学染色图像（E），包括 H&E 染色（比例尺，250 μm）、油红 O 染色、Masson 三色染色（比例尺，500 μm）和 Sirius Red 染色（比例尺，100 μm），以及对应的定量分析（F），验证 EgE 可剂量依赖性改善肝脂肪变性、炎症浸润和肝纤维化。数据以均值 ± SD 表示。## < 0.001，与 MCS 组相比；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，与 MCD 组相比。

转录组分析提示 EgE 通过调控肝脏脂质代谢和 ERS 改善 MASLD

为阐明 EgE 改善 MASLD 的分子机制，研究者对 ND、HFD 和 HFD+EgE-40 组小鼠肝组织进行了 RNA-seq 分析。主成分分析（PCA）显示，三组样本在转录组水平上明显分离，前两个主成分累计解释超过 60% 的方差。采用严格筛选标准后，研究者在 EgE-40 组与 HFD 组之间鉴定出 904 个差异表达基因，其中 581 个上调、323 个下调。

KEGG 通路富集分析显示，这些差异基因显著富集于“视黄醇代谢”“亚油酸代谢”“类固醇激素生物合成”和“内质网蛋白加工”等通路。GO 富集分析也显示，细胞组分“内质网”和生物过程“细胞脂质代谢过程”明显富集。进一步采用 GSEA 分析 KEGG 和 Hallmark 基因集，结果与 KEGG 和 GO 富集高度一致。因此，后续研究重点验证了脂质代谢和 ERS 通路。

脂质代谢相关基因热图显示，与 ND 组相比，HFD 组上调脂质生成关键基因 Mvd、Dgat2、Acaca 和 Fasn，同时下调脂解相关基因 Ppargc1b、Acox1、Pparα 和 Cpt1a；EgE-40 则逆转了这些异常表达模式。qRT-PCR 和 Western blot 进一步验证，EgE-40 显著降低脂质生成基因 Acaca、Fasn、Dgat2 的 mRNA 水平，并升高脂解基因 Cpt1a 和 Pparα 的 mRNA 水平。在蛋白水平上，EgE-40 剂量依赖性抑制脂肪酸合酶（FASN）和核型固醇调节元件结合蛋白 1（nSREBP1），同时升高肉碱棕榈酰转移酶 1a（CPT1a）水平。

探索性 KEGG 通路分析还显示半乳糖代谢轻度富集。其中，参与肝脏糖异生的关键基因 G6pc 明显下调，并经 qPCR 验证。该糖异生抑制作用可能是 EgE 改善全身葡萄糖稳态的重要原因之一。

考虑到 ERS 在 MASLD 发生发展中的关键作用，研究者进一步分析“内质网蛋白加工”通路中相关基因的表达模式。GSEA 显示，EgE 显著逆转了 HFD 诱导的 ERS 相关基因集上调。相应热图也显示，核心 ERS 相关基因整体下调。EgE 明显降低关键内质网伴侣蛋白 Hspa5（编码 GRP78）及其促凋亡下游效应分子 Ddit3（编码 CHOP）的 mRNA 和蛋白水平；在 MCD 饮食诱导模型中，同样观察到 GRP78 和 CHOP 被抑制。此外，EgE 在两种模型中均削弱三条经典 ERS 感受器通路的激活/表达，包括 p-IRE1α、p-PERK 和 ATF6。

这些结果表明，EgE 通过协同调控糖脂代谢并减轻 ERS，改善肝脏脂质积累，为其抗 MASLD 作用提供了关键机制依据。

图4：转录组分析揭示 EgE 改善 HFD 诱导 MASLD 小鼠的潜在机制（每组 n = 4）。（A）ND、HFD 和 EgE-40 组 RNA-seq 数据的 PCA 图。（B）EgE-40 组与 HFD 组之间差异表达基因（DEGs）的 KEGG 通路富集分析。（C）差异表达基因的 GO 功能富集分析。（D）基于 RNA-seq 数据的脂质代谢相关基因表达谱热图，并结合 RT-qPCR 和 Western blot（WB）检测关键脂质合成基因（Acaca、Fasn 和 Dgat2）以及脂质降解基因（Cpt1a 和 Pparα）的相对 mRNA 和蛋白水平。（E）EgE-40 组与 HFD 组之间内质网蛋白加工通路的 GSEA 分析。（F）基于 RNA-seq 数据的 ERS 相关基因表达谱热图，并结合 RT-qPCR 和 WB 检测 HFD、EgE-10、EgE-20 和 EgE-40 组中 Hspa5 和 Ddit3 的相对 mRNA 水平及其对应蛋白 GRP78 和 CHOP 的水平。（G）WB 验证 MCD 饮食诱导 MASLD 小鼠肝脏中 GRP78 和 CHOP 蛋白表达。（H）WB 分析 HFD 诱导及 EgE 处理组中三种经典 ERS 感受器蛋白水平，包括 pIRE1α S724、pPERK T980 和 ATF6。## < 0.001，与对照组相比；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，与 HFD 组相比。

EgE 主要成分鉴定及体外降脂活性筛选

研究者采用色谱和波谱相结合的方法，从 EgE 中分离并鉴定出 8 种杂萜类成分。这些成分在蓝桉果实水煎液中也可检测到，但含量相对较低。通过将 1H NMR 和 13C NMR 数据与文献报道进行比较，研究者将其鉴定为 Macrocarpal A（MA）、Macrocarpal E（ME）、Macrocarpal B（MB）、Macrocarpal D（MD）、Macrocarpal L（ML）、Macrocarpal M（MM）、Macrocarpal O（MO）和 Macrocarpal Q（MQ）。

随后，研究者使用相应对照品建立 HPLC 定量方法，并对主要成分进行检测。方法学验证显示，8 种杂萜类化合物均具有良好线性关系，相关系数 r² > 0.99；精密度、重复性和稳定性的相对标准偏差均小于 2.5%。10 批 EgE 的 HPLC 指纹图谱具有高度一致性，样品相似度均大于 0.99，提示药材批间一致性较好。定量分析显示，MA 是 EgE 中含量最高的成分，含量为 24.62 mg/g。

为评价这 8 种杂萜类成分的降脂作用，研究者在 FFA 诱导的 HepG2 细胞中检测细胞内 TG 含量。结果显示，8 种成分均可抑制 FFA 诱导的脂质积累，抑制率为 10.2%–47.5%。其中 MA 活性最强，可使细胞内 TG 含量降低 47.5 ± 6.6%。油红 O 染色进一步支持该结果。BODIPY 荧光染色显示，MA 的降脂作用呈剂量依赖性，且在相同剂量下作用与 Rsv 相当。因此，MA 被确定为 EgE 的主要降脂活性成分。

图5：主要成分的植物化学分析及体外降脂筛选。（A）EgE 中化学成分的代表性 HPLC 色谱图。（B）通过 NMR 鉴定的 8 种成分化学结构。（C）10 批 EgE 的代表性 HPLC 指纹图谱（相似度 > 0.9）。（D-E）FFA 刺激 HepG2 细胞后，在有无单一成分（10 µM）处理条件下的 TG 定量检测结果（D）和代表性油红 O 染色图像（比例尺，50 μm）（E）。（F）FFA 诱导 HepG2 细胞在有无 MA 干预（2.5–10 µM）条件下的代表性 BODIPY 染色图像（比例尺，200 μm）。## < 0.001，与对照组相比；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，与仅 FFA 处理组相比。

EgE 通过激活 IRE1α/XBP1s 通路减轻肝细胞脂质积累

为寻找 EgE 的蛋白靶点，研究者整合了计算靶点预测、疾病相关基因挖掘和实验靶点验证三种策略。首先，通过 SuperPred 3.0 和 PharmMapper 在线平台预测 8 种成分的潜在靶点，共获得 383 个高置信候选蛋白靶点。其次，系统挖掘 GeneCards 数据库中与 MASLD 相关的基因，获得 998 个相关性评分高于中位数的蛋白编码基因。第三，研究者开展 DARTS 实验，并对差异蛋白条带进行质谱蛋白组学分析，鉴定出 1110 个候选结合蛋白。三类靶点列表整合后，最终汇聚出 5 个高优先级候选蛋白。

在所有候选靶点中，IRE1α 在筛选策略中排名最高，其最高评分来自质谱分析。CETSA 结果显示，EgE 可在热应激条件下显著增加 IRE1α 的热稳定性。DARTS 结合免疫印迹实验进一步显示，EgE 可浓度依赖性增强 IRE1α 稳定性。由于 XBP1s 是 IRE1α RNase 活性的直接功能读出，研究者进一步检测 XBP1 mRNA 剪接。结果显示，EgE 在 HepG2 细胞中剂量依赖性促进 XBP1 mRNA 剪接，但并不改变 IRE1α 的 mRNA 或蛋白表达水平。

当研究者加入选择性 XBP1s 抑制剂 4μ8c 后，EgE 诱导的 XBP1s 转录变化被明显逆转。下游 UPR 靶基因的转录组分析进一步提示，EgE 对 IRE1/XBP1 信号通路具有优先调节作用。动物模型中，EgE 给药同样显著提高 HFD 和 MCD 饮食诱导 MASLD 小鼠肝脏核内 XBP1s 蛋白水平。

为了验证 IRE1α/XBP1s 通路是否参与 EgE 的抗 MASLD 作用，研究者在 FFA 诱导的脂肪变性细胞模型中使用选择性 IRE1α/XBP1s 激活剂 IXA4 和抑制剂 4μ8c。IXA4 被证实可改善脂质积累；而 4μ8c 与 EgE 共处理可显著削弱 EgE 降低 HepG2 和 AML12 细胞内脂滴积累的作用。进一步的转录检测显示，在 FFA 诱导的 HepG2 脂肪变性模型中，EgE 显著抑制糖异生关键基因 G6PC、PCK1 以及脂质生成基因 SREBF1C、DGAT2 的表达；而 4μ8c 几乎消除了 EgE 对脂质转运相关基因 PDIA4 和 SEC24D 的上调作用。

这些结果表明，EgE 可通过激活 IRE1α/XBP1s 通路，减轻 MASLD 中的肝脏脂质积累。

图6：EgE 通过激活 IRE1α/XBP1s 通路减轻肝脏脂质积累。（A-B）DARTS 实验流程示意图（A），以及经考马斯亮蓝染色 SDS-PAGE 凝胶可视化的代表性 DARTS 实验结果（B）。（C）维恩图展示通过整合筛选策略识别出的 EgE 潜在靶蛋白交集，该策略包括计算靶点预测（SuperPred、PharmMapper）、MASLD 相关基因挖掘（GeneCards）以及 DARTS 实验靶点验证。（D）基于整合筛选策略得到的前 5 个高优先级候选蛋白。（E-F）通过 CETSA（E）以及 DARTS 结合免疫印迹（F）验证 IRE1α 是 EgE 的潜在靶点。（G）代表性 cDNA 凝胶图像显示，EgE（0–10 µg/mL）在 HepG2 细胞中浓度依赖性诱导 XBP1 mRNA 剪接。（H-I）EgE 驱动的 IRE1α/XBP1s 激活介导肝细胞降脂作用。（H）采用 RT-qPCR 检测 HepG2 细胞经 EgE 和/或选择性 IRE1α RNase 抑制剂 4µ8c（10 µM）处理后的 XBP1s mRNA 水平。（I）HepG2 细胞脂滴的代表性 BODIPY 染色图像，显示 4µ8c（10 µM）共处理可消除 EgE 的降脂作用。比例尺，20 μm。（J-K）EgE 驱动的 XBP1s 激活调控糖脂代谢基因转录。（J）采用 WB 检测有无 EgE 处理小鼠的肝脏 XBP1s 蛋白表达。（K）采用 RT-qPCR 检测 HepG2 细胞经 EgE（10 µg/mL）和/或 4µ8c（10 µM）处理后，糖异生基因（G6PC1、PCK1）、脂质生成基因（SREBF1c、DGAT2）和脂质转运基因（PDIA4、SEC24D）的 mRNA 水平。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。

主要活性成分 MA 结合 IRE1α 的 h1 口袋并提高其二聚体水平

在 EgE 的 8 种成分中，MA 含量最高且降脂活性最强，因此研究者选择 MA 进行进一步机制研究。CETSA 结果验证了 MA 与 IRE1α 的潜在相互作用。随后，研究者使用无细胞荧光探针实验，定量检测 MA 对重组 IRE1α RNase 活性的影响。结果显示，无论是否存在 ADP，MA 均可显著增强 IRE1α RNase 活性。值得注意的是，过量 ADP 并不能竞争性阻断 MA 驱动的 IRE1α 激活，反而表现出协同作用，提示 MA 并不占据经典核苷酸结合口袋。Western blot 检测还显示，MA 干预 2–12 h 内并未上调 Ser724 位点的 IRE1α 磷酸化水平。

由于二聚化对于 IRE1α RNase 活性不可或缺，研究者进一步对 IRE1α 二聚化界面上已知配体结合口袋进行计算对接分析。含关键残基 H692 的口袋是促进 IRE1α 二聚化的结合位点，但 MA 在该口袋中未能形成稳定结合模式。相反，MA 与 IRE1α h1 口袋对接时显示出较高亲和力，结合能为 −7.2 kcal/mol，并与 Tyr960(B)、Arg955(B) 和 Gln840(A) 形成氢键相互作用。分子动力学模拟进一步验证了 MA-IRE1α 二聚体复合物的稳定性，表现为整体骨架 RMSD 较低、小于 2.5 Å，关键结合残基 RMSF 较低、小于 4 Å，且回转半径 Rg 较低、小于 30 Å。这些计算结果提示，h1 位点可能是 MA 作用于 IRE1α 的功能性结合口袋。

为进一步实验验证 MA 与 h1 口袋的相互作用，研究者首先进行计算机丙氨酸扫描，预测可能参与 MA 结合的关键残基。结果显示，每个突变均显著提高计算结合自由能。随后，研究者在 HEK293T 细胞中转染编码野生型 IRE1α（WT）或三突变体 IRE1α（MUT；Y960A/R955A/Q840A）的质粒。化学交联结合 Western blot 显示，IRE1α-MUT 的基础二聚化未发生改变，但在 IRE1α-WT 中观察到的 MA 诱导 IRE1α 二聚体增加，在突变体中大部分消失。CETSA 结果也显示，MA 可显著稳定 WT-IRE1α，但对三突变体没有明显热稳定作用。

这些发现表明，h1 口袋中的 Tyr960(B)、Arg955(B) 和 Gln840(A) 对 MA 介导的 IRE1α 二聚体水平升高具有关键作用。

图7：MA 结合 h1 口袋并增加 IRE1α 二聚体形式。（A）CETSA 验证 MA 与 IRE1α 之间的潜在相互作用。（B）在仅有 IRE1α 或存在腺苷二磷酸（ADP，1 mM）、MA（10 µM）或 ADP+MA 条件下，IRE1α 介导底物剪切的时间进程荧光曲线。（C）MA-IRE1α 结合模式的分子对接。（D-F）通过分子动力学模拟评估 MA-IRE1α 复合物的结构稳定性。（D）均方根偏差（RMSD）；（E）回转半径（Rg）；（F）均方根波动（RMSF）。（G）丙氨酸扫描分析，将目标氨基酸残基定点突变为丙氨酸后 MA-IRE1α 结合亲和力的变化。（H-I）h1 口袋残基在 MA 介导 IRE1α 结合和二聚化中的关键作用。（H）MA 对 HEK293T 细胞中野生型 IRE1α（IRE1α-WT）和突变型 IRE1α（IRE1α-MUT）二聚化的影响。（I）在过表达 IRE1α-WT 或定点突变 IRE1α 的 HEK293T 细胞中，采用 CETSA 分析 MA-IRE1α 相互作用。

MA 通过激活 IRE1α/XBP1s 通路调节糖脂代谢，且不诱导过度病理性 RIDD 活性

前述结果显示，MA 可通过增加 IRE1α 二聚化促进 XBP1s 剪接。基于 EgE 通过该通路改善糖脂代谢并发挥降脂作用的观察，研究者进一步验证 MA 是否也依赖 IRE1α/XBP1s 信号轴减轻肝脏脂质积累。

在 FFA 诱导的 HepG2 脂肪变性模型中，MA 剂量依赖性促进 XBP1 mRNA 剪接；4μ8c 几乎完全阻断了 MA 诱导的 XBP1s mRNA 上调。随后，研究者采用 siRNA 介导 IRE1α 敲低。si-IRE1α 可有效抑制 IRE1α 的 mRNA 和蛋白表达，并伴随剪接型活性异构体 XBP1s 降低。在基础状态下，即没有 FFA 诱导的脂毒性应激或 MA 处理时，IRE1α 敲低并未显著影响 SREBF1c 表达或细胞内 TG 含量，提示 IRE1α 并不参与基础脂质生成的构成性调控，而是在特定应激背景下调节脂质代谢。

相反，在 FFA 诱导背景下，IRE1α 敲低显著升高糖异生基因 G6PC 和 PCK1 的表达，并几乎消除 MA 对这些基因的抑制作用。与此同时，MA 可显著上调对照肝细胞中 PDIA4 和 SEC24D 的表达，并减少 ApoB 细胞内滞留；但 IRE1α 敲低明显削弱 MA 对 PDIA4、Sec24D 和 ApoB 的调控作用。MA 还可促进对照 siRNA 转染细胞的 TG 分泌，而 IRE1α 敲低几乎完全消除了这一促进作用。

这些结果通过药理学抑制和遗传学沉默两种互补策略证明，MA 通过 IRE1α/XBP1s 依赖性方式调节糖脂代谢，从而减轻肝脏脂质积累。

与此同时，研究者还关注 MA 激活 IRE1α/XBP1s 通路时是否会诱发不良下游输出。IRE1α 二聚化程度会直接决定其 RNase 活性。分子胶化合物维替泊芬（verteporfin，VP）在体外与重组 IRE1α 蛋白孵育时，可明显促进 IRE1α 二聚化；而在相同条件下，MA 处理组 IRE1α 二聚体条带强度仅轻度增加。细胞实验也显示，VP 处理组 IRE1α 二聚体水平明显高于 MA 处理组；VP 组二聚体/单体比值为 1.9 倍，而 MA 组为 0.9 倍。

适度激活 IRE1α RNase 主要通过 XBP1s 介导适应性反应；但 RNase 过度激活会触发过度 RIDD 和 JNK 依赖性凋亡等不适应性效应。因此，研究者以 VP 为对照，评估 MA 是否诱导不良反应。在 HepG2 细胞中，VP 处理 4 h 诱导的 XBP1 剪接显著强于 MA，并触发 RIDD 靶基因 SCARA3、HGSNAT 和 PPP2R1A 降解；而 MA 仅促进 XBP1 剪接。处理 12 h 后，VP 进一步使 XBP1s 蛋白升高至约为 MA 组的 2 倍，并强烈下调 RIDD 相关基因，其中 PPP2R1A mRNA 较对照降低约 5 倍；相比之下，MA 仅使这些 RIDD 靶标出现轻度、无统计学意义的降低。

结合 MA 的药代动力学特征，研究者进一步分析 MA 处理后 IRE1α 信号通路的时间表达模式。在普通饲料喂养小鼠中，单次口服 10 mg/kg MA 后，肝脏 Xbp1s mRNA 在 4 h 显著升高，8 h 开始下降，24 h 恢复至基线。经典 XBP1s 靶基因 Dnajb9 表现出相似变化。值得注意的是，RIDD 靶基因在所有时间点均未相对溶媒组发生改变。此外，EgE 也未触发 IRE1α RNase 活性的有害下游输出，如过度 RIDD 加工和 JNK 信号高激活。F4/80 免疫组化染色进一步证实，持续 EgE 干预可减轻肝脏巨噬细胞浸润并减少肝细胞凋亡。

这些结果说明，长期 MA 处理并不会诱发 IRE1α 信号通路的有害脱靶激活。

图8：IRE1α/XBP1s 通路介导 MA 对 MASLD 的改善作用，且不诱导过度病理性 RIDD 活性。（A）代表性 cDNA 凝胶图像显示，MA（0.2–5 µM）在 HepG2 细胞中浓度依赖性诱导 XBP1 mRNA 剪接。（B）在暴露于 MA（5 µM）和/或选择性抑制剂 4µ8c（10 µM）的 HepG2 细胞中，采用 RT-qPCR 评价 MA 对 XBP1s 激活的 IRE1α 依赖性。（C-D）HepG2 细胞转染非沉默对照 siRNA 或 IRE1α 靶向 siRNA 后，经溶媒或 MA（10 µM）预处理，分别采用 RT-qPCR 和 WB 检测 IRE1α 与 XBP1s 的 mRNA（C）和蛋白（D）表达。（E）按（C-D）所述方式处理 HepG2 细胞后，检测糖异生基因（G6PC、PCK1）和脂质转运基因（PDIA4、SEC24D）的 mRNA 水平。（F-G）按（C-D）所述方式处理 HepG2 细胞后，采用 WB 分析 ApoB100、PDI 和 MTTP 蛋白表达（F），并定量检测分泌性 TG（G）。（H-I）不同处理条件下 IRE1α 二聚化水平比较：（H）重组 IRE1α 蛋白与溶媒、10 µM MA 或 10 µM VP 孵育 30 min 后进行体外化学交联实验；（I）WB 分析 HepG2 细胞经 10 µM MA 或 10 µM VP 处理后的细胞内 IRE1α 二聚化。（J）采用 RT-qPCR 分析 HepG2 细胞经溶媒、MA（10 µM）和/或 VP（10 µM）处理 4 h 或 12 h 后，XBP1s、其靶基因 DNAJB9 以及 RIDD 相关基因（BLOC1S1、SCARA3、HGSNAT、PPP2R1A）的 mRNA 水平，从而确定 MA 和 VP 对 IRE1α-RNase 下游信号的不同激活模式。（K）普通饲料喂养小鼠单次口服 MA（10 mg/kg）后 4、8 和 24 h，采用 RT-qPCR 分析肝脏 Xbp1s、其靶基因 Dnajb9 以及 RIDD 相关基因（Scara3、Ppp2r1a）的 mRNA 水平，从而表征 MA 对肝脏 IRE1α 下游信号的适应性激活特征。每组 n = 4 只小鼠。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001（双因素 ANOVA）。

【贡献】★★★★★

本研究表明，EgE 可通过激活 IRE1α/XBP1s 信号轴，纠正肝脏糖脂代谢紊乱，从而在 HFD 和 MCD 诱导的 MASLD 小鼠模型中改善疾病表型。其主要成分 MA 是首个经验证能够结合 IRE1α h1 口袋的配体。这些发现强调了激活 IRE1α/XBP1s 轴在不同病理背景 MASLD 中的治疗潜力，也提示蓝桉果实提取物有望成为 MASLD 干预的植物来源候选物。

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