Hepatology (1区，IF=18.0)丨MASH新靶点GPR75：通过GNAI2-cAMP-PKA轴加重肝脂质合成与纤维化！(谢媛/王广基—中国...

2026年2月3日，中国药科大学谢媛、王广基团队等，联合中国药科大学南京鼓楼医院，在Hepatology（中科院1区，IF=18.0）在线发表题为 “Hepatic GPR75 exacerbates MASH through GNAI2-dependent signaling” 的研究论文。该文于2025年9月23日投稿，2026年1月20日接收。Hepatology 为肝病学领域权威期刊，2026 JCR Impact Factor=18.0；按常用中科院期刊分区信息，该刊位于医学大类1区、胃肠肝病学小类1区。

这项研究聚焦代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）进展中的肝脏 GPR75。研究发现，健康状态下肝脏 GPR75 表达并不丰富，但在 MASH 过程中其蛋白水平明显升高。无论是全肝敲低 Gpr75，还是肝细胞特异性敲除 Gpr75，均可减轻饮食诱导的小鼠肝脂肪变性、炎症和纤维化；相反，肝细胞特异性过表达 Gpr75 会加重 MASH 表型。机制上，GPR75 与 GNAI2 相互作用，并通过 GNAI2-cAMP-PKA 信号轴影响 SREBP-1c成熟和肝脏新生脂肪生成；同时，VPS35 可将 GPR75 回收至肝细胞膜，从而稳定其蛋白水平。研究还筛选出小分子化合物 X201415，提示靶向 GPR75 可能为 MASH 干预提供新的研究方向。

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【摘 要】

代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）及其更严重的形式——代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH），正日益成为重要的全球健康问题。本研究旨在探讨肝脏 GPR75 在 MASH 进展中的作用。

尽管在健康个体中，GPR75 在肝脏中的表达并不丰富，但其蛋白水平在 MASH 过程中显著升高。无论是在全肝范围内减少 Gpr75，还是在肝细胞中特异性减少 Gpr75，均可保护小鼠免受饮食诱导的肝脂肪变性；相反，肝细胞特异性过表达 Gpr75 会加重饮食诱导的 MASH 和肝纤维化。肝脏 Gpr75 缺失可激活 MASLD 小鼠肝脏中的 GNAI2-cAMP-PKA 信号通路，从而减少 SREBP-1c 成熟和新生脂肪生成。机制上，VPS35 可通过将 GPR75 回收至肝细胞膜来稳定 GPR75，从而在 MASH 进展过程中减少其降解。

本研究表明，GPR75 可通过调控肝脏脂肪酸代谢，作为 MASLD/MASH 的新型调节因子。这些发现提示，抑制 GPR75 可能成为 MASLD/MASH 治疗的潜在策略。

关键词：新生脂肪生成，GNAI2，GPR75，MASH，VPS35

01

研究背景及科学问题

代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH，既往称为非酒精性脂肪性肝炎，NASH）是代谢综合征在肝脏中的表现，目前已成为慢性肝病的主要病因。其关键病理特征之一是肝脏脂质代谢失衡，涉及脂质合成、储存、动员和分解代谢等多个环节。肝脂肪变性是 MASLD 发生发展的早期标志，主要源于过量游离脂肪酸在细胞质脂滴中以三酰甘油形式储存；这些游离脂肪酸可来自循环输入增加，也可来自肝内新生脂肪生成。然而，肝内三酰甘油长期堆积可通过脂质过氧化促进肝脏胰岛素抵抗和肝细胞损伤，并进一步驱动 MASH 相关炎症和纤维化。过去十年间，MASLD 的全球患病率明显升高，但针对该疾病的药物治疗选择仍然有限。

G 蛋白偶联受体 75（GPR75）是 GPCR 家族中的孤儿受体，广泛表达于人体多个组织，包括脑、视网膜、肾脏、心脏和前列腺。人类遗传学研究发现，GPR75 基因变异与体脂减少和体重指数降低有关。与人类数据一致，在小鼠中删除 Gpr75 可抵抗高脂饮食（HFD）诱导的肥胖，改善胰岛素敏感性，并增强血糖控制。此外，对 UK Biobank 428,719 名参与者全外显子测序数据的分析显示，GPR75 变异与肝脂肪变性风险降低相关；在小鼠中遗传性失活 Gpr75 也可防止 NAFLD 并减少脂肪积累。这些发现共同提示，GPR75 主要在脑内表达，并可能通过调控摄食影响肥胖和肝脂肪变性。然而，GPR75 调控 MASH 的机制仍不清楚，GPR75 是否直接调节肝脏和脂肪组织中的脂质积累也尚未明确。

近期研究发现，RANTES（CCL5）和 20-羟基二十碳四烯酸（20-HETE）是 GPR75 的内源性配体。CCL5 在肝脏炎症和纤维化进展中发挥重要作用。花生四烯酸可被细胞色素 P450 酶 4A 和 4F 家族代谢生成 20-HETE，而 20-HETE 对激活 GPR75 受体、诱导血管收缩和细胞增殖具有重要意义。已有研究显示，20-HETE 可促进高脂饮食小鼠发生胰岛素抵抗，而 20-HETE 受体阻断剂可预防这一过程。趋化因子 CCL5 可在 GPR75 过表达细胞、胰岛和神经母细胞瘤细胞系中，通过 Gqα 蛋白介导的信号转导通路激活 GPR75。研究者还观察到 GPR75 可与 Gi-arrestin 和 β-arrestin 发生组成性偶联。

尽管某些促进瘦体型的遗传改变反而可能增加脂肪肝风险，但 GPR75 在肝脏中的作用仍未得到充分探索。为弥补这一空白，作者研究了 GPR75 在 MASLD 中的功能。本研究显示，肝细胞特异性敲除 Gpr75（Gpr75fl/fl TBGCre）可减轻肝脏脂质积累，而肝细胞中过表达 Gpr75 则会加重高脂饮食诱导小鼠的 MASH。随后，研究者鉴定出 GNAI2 是与 GPR75 偶联的 G 蛋白，并发现 GPR75 可通过 GNAI2-cAMP-PKA 通路抑制 SREBP 家族蛋白（SREBP1c/2）的表达，从而影响新生脂肪生成和炎症反应。最后，研究者证明，GPR75 蛋白水平受 VPS35 影响；VPS35 是 retromer 复合体中的重要组分，可将 GPR75 运回细胞膜并维持其蛋白水平。本研究也提出，GPR75-GNAI2 通路可能是 MASH 的潜在治疗靶点。

02

重要发现及亮点

肝脏 GPR75 蛋白在 MASH 患者和小鼠肝脏中上调

既往大规模外显子测序研究发现，GPR75 功能缺失变异与抗肥胖相关。已有证据表明，GPR75 在小鼠脑组织中高表达，但在肝脏中的 mRNA 表达较低。作者首先基于 Gene Expression Omnibus（GEO）数据库分析发现，与正常对照相比，无论是 MASH 患者还是小鼠肝脏中，GPR75 mRNA 水平均未出现显著变化。值得注意的是，免疫组织化学染色显示，在人肝组织样本中，GPR75 蛋白水平从 MASH 到肝纤维化呈逐渐升高趋势。

在小鼠模型中，作者使用高脂饮食（HFD）或胆碱缺乏、L-氨基酸定义高脂饮食（CDAHFD）诱导 MASH。多种 qRT-PCR 检测均显示，肝脏 Gpr75 mRNA 表达并无显著变化。进一步通过 Western blot 检测蛋白水平时，作者以小鼠脑组织作为阳性对照，并使用 GPR75 抗体封闭肽验证抗体特异性。结果显示，HFD 和 CDAHFD 饮食均可使小鼠肝脏 GPR75 蛋白水平升高，提示 GPR75 在 MASH 中可能受到转录后调控。免疫荧光染色也进一步证实，在 MASH 进展过程中，肝脏 GPR75 蛋白表达增加。

图1：MASH 患者和小鼠肝脏中肝脏 GPR75 蛋白表达上调。（A）基于 Gene Expression Omnibus（GEO）数据库公开数据集（GSE48452、GSE89632、GSE32095、GSE35961）分析 GPR75 mRNA 的基因表达。（B）在人正常对照肝组织（n = 7）以及 MASH 和纤维化患者肝组织（n = 6）切片中进行 GPR75 免疫组织化学染色。阳性染色区域使用 ImageJ 软件进行定量。比例尺：100 µm。（C）左图：高脂饮食（HFD）喂养 16 周小鼠肝组织切片的代表性 H&E 染色和油红 O 染色（n = 6）。比例尺：100 µm。右图：采用 TaqMan 探针和 SYBR Green qRT-PCR 检测 HFD 喂养小鼠肝脏中 Gpr75 mRNA 表达（n = 6）。下方：HFD 喂养小鼠肝脏中 GPR75 蛋白水平（n = 4 个生物学重复/组）。（D）左图：CDAHFD 喂养 6 周小鼠肝组织切片的 H&E 染色和油红 O 染色（n = 6）。比例尺：100 µm。右图：采用 TaqMan 探针和 SYBR Green qRT-PCR 检测 CDAHFD 喂养小鼠肝脏中 Gpr75 mRNA 表达（n = 6）。下方：CDAHFD 喂养小鼠肝脏中 GPR75 蛋白水平（n = 4 个生物学重复/组）。（E，F）HFD（E）或 CDAHFD（F）喂养小鼠肝脏中 GPR75 的免疫荧光染色。比例尺：50 µm（n = 6）。所有图中：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，ns 表示无统计学意义。数据以 mean ± SEM 表示；采用双尾非配对 Student t 检验。缩写：CDAHFD，胆碱缺乏、L-氨基酸定义高脂饮食；GPR75，G 蛋白偶联受体 75；HFD，高脂饮食；MASH，代谢功能障碍相关脂肪性肝炎；ND，普通饮食。

肝脏 Gpr75 缺失减轻 MASH 进展

为明确肝脏 GPR75 上调是否介导 MASH 进展，作者构建了腺相关病毒 8 型（AAV8）介导的肝脏 Gpr75 敲低小鼠，并给予 CDAHFD 饮食。mRNA 和蛋白水平均证实敲低有效。Gpr75 敲低显著降低肝脏重量/体重比，但未影响整体体重。组织学分析显示，肝脏 Gpr75 敲低小鼠的肝内脂质积累和气球样变减轻，同时肝脏三酰甘油（TG）、总胆固醇和非酯化脂肪酸水平均下降。进一步检测脂质代谢相关基因后发现，降低肝脏 GPR75 表达可下调脂肪酸和 TG 合成相关基因，而对脂肪酸 β-氧化或摄取相关基因影响不明显。这提示 GPR75 可能主要影响肝脏脂肪酸合成过程。

鉴于脂毒性、肝细胞损伤、炎症和纤维化在 MASH 进展中具有核心作用，作者进一步评估 Gpr75 敲低对这些病理特征的影响。Masson 染色、天狼星红染色以及肝星状细胞活化标志蛋白 α-SMA 染色均提示，Gpr75 敲低可减少肝脏胶原沉积面积。此外，促炎性 M1 型巨噬细胞标志物 CD11b 和 F4/80 的表达显著降低。Western blot 和免疫荧光染色也证实 α-SMA 蛋白水平明显下降。q-PCR 分析进一步显示，Gpr75 敲低小鼠肝脏中关键纤维化相关基因 Col1a1、Tgfβ、Ctgf 以及炎症相关基因 Tnfα、Il1β、Il6、Mcp1 的 mRNA 表达均下调。血清 ALT 和 AST 水平下降也支持其对 MASH 进展的保护作用。总体而言，这些数据表明，降低 Gpr75 表达可抵抗饮食诱导的 MASH 和肝脂肪变性。

图2：肝脏 Gpr75 缺失减轻 MASH 进展。（A）用于研究 Gpr75 在 MASH 中作用的小鼠肝脏 Gpr75 敲低示意图。（B）对照组和 shGpr75 小鼠的肝脏重量/体重比（n = 7）。（C）肝组织切片代表性 H&E 染色和油红 O 染色。比例尺：100 µm（n = 6）。（D）肝脏甘油三酯、总胆固醇和游离脂肪酸（FFA）水平（n = 7）。（E）qRT-PCR 分析肝组织中与脂质摄取、脂肪酸 β-氧化和脂肪酸合成相关的基因（n = 7）。（F）Masson 染色和免疫组织化学（IHC）分析肝纤维化。比例尺：100 和 200 µm（n = 6）。（G）α-SMA 相对蛋白水平。GAPDH 作为上样对照（n = 6 个生物学重复/组）。（H，I）与肝脏炎症（H，n = 6）和纤维化（I，n = 7）相关基因的 mRNA 表达。（J）血清 ALT 和 AST 水平（n = 7）。所有图中：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，ns 表示无统计学意义。数据以 mean ± SEM 表示；采用双尾非配对 Student t 检验。缩写：AAV8，腺相关病毒 8 型；Acc1，乙酰辅酶 A 羧化酶 1；Cd36，分化簇 36；COL1A1，胶原 1a1；Cpt-1α，肉碱棕榈酰转移酶 1α；Cpt-2，肉碱棕榈酰转移酶 2；Ctgf，结缔组织生长因子；Dgat，二酰甘油酰基转移酶；Fasn，脂肪酸合酶；Gpat，甘油-3-磷酸酰基转移酶；Mcp1，单核细胞趋化蛋白 1；Tgfβ，转化生长因子 β；NEFA，非酯化脂肪酸；Pparα，过氧化物酶体增殖物激活受体 α；Scd1，硬脂酰辅酶 A 去饱和酶 1；Srebp-1c，固醇调节元件结合蛋白 1c；TC，总胆固醇；TG，甘油三酯；Tnfα，肿瘤坏死因子 α；α-SMA，α-平滑肌肌动蛋白。

肝细胞特异性 Gpr75 缺失改善肝脂肪变性和组织损伤

为了明确 MASH 肝脏中上调的 GPR75 主要位于哪些细胞，作者进行了免疫荧光染色。结果显示，GPR75 主要在 Albumin 阳性肝细胞中增加。此外，棕榈酸（PA）处理后，小鼠原代肝细胞和 HepG2 细胞中的 GPR75 水平均升高。因此，作者构建了肝细胞特异性 Gpr75 缺失小鼠（Gpr75hko，基因型为 Gpr75fl/fl TBGCre），并给予 CDAHFD 饮食 8 周。肝组织免疫荧光染色证实 GPR75 成功删除。与 Gpr75fl/fl 对照小鼠相比，Gpr75hko 小鼠肝脏重量/体重比较低，H&E、油红 O 和 Masson 染色显示其肝脂肪变性更轻。

这一保护性表型还表现为血清 ALT 和 AST 水平降低，肝脏 TG 和非酯化脂肪酸含量下降，以及脂质代谢相关基因表达下调。同时，与 Gpr75fl/fl 对照相比，Gpr75hko 小鼠肝脏中 α-SMA 和细胞外基质标志物表达降低，提示纤维化减轻；巨噬细胞浸润减少，炎症因子 Il-1β、Il-6 和 Tnfα 水平也下降。

进一步在 12 周 HFD 模型中验证时，肝细胞特异性 Gpr75 消融并未改变食物摄入，但 Gpr75hko 小鼠体重增加较少，并表现出更低的空腹血糖和更强的胰岛素敏感性，提示其系统代谢状态改善。肝细胞特异性 Gpr75 缺失也可减轻肝脂肪变性、降低 TG 含量，并使血浆 ALT、TG 和总胆固醇水平下降。脂肪酸合成相关基因表达也发生相应变化。基于质谱成像的质荷比计算还显示，Gpr75hko 小鼠肝脏中疑似 TG、二酰甘油和胆固醇酯明显减少。

总体而言，这些结果表明，在 HFD 喂养小鼠中，肝细胞特异性删除 Gpr75 可改善已形成 MASH 的关键病理特征，包括肝脂肪变性、纤维化、炎症和肝损伤。

图3：肝细胞特异性 Gpr75 缺失改善肝脂肪变性和组织损伤。（A）CDAHFD 喂养 8 周小鼠肝组织切片中 GPR75（红色）和 Albumin（绿色）的免疫荧光染色。比例尺：50 µm（n = 5）。（B）通过 Western blot 检测原代肝细胞和 HepG2 细胞中 GPR75 的相对蛋白水平（n = 5–6 个生物学重复/组）。（C）上方：MASH 饮食喂养条件下肝细胞特异性 Gpr75 敲除小鼠示意图。下方：Gpr75fl/fl 和 Gpr75hko 小鼠中 GPR75 的免疫荧光分析。比例尺：50 µm（n = 7）。（D）Gpr75fl/fl 和 Gpr75hko 小鼠肝脏重量/体重比（n = 7）。（E）肝组织切片代表性 H&E、Masson 三色和油红 O 染色。比例尺：200 µm（n = 6）。（F）血清 ALT 和 AST 活性，以及 TG 和 NEFA 水平（n = 7）。（G）肝组织中脂质代谢相关基因的 mRNA 表达（n = 7）。（H）qRT-PCR 分析纤维化相关基因表达（n = 7）。（I）F4/80 免疫荧光染色。比例尺：100 µm（n = 3）。（J）炎症相关基因的相对 mRNA 表达（n = 7）。所有图中：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，ns 表示无统计学意义。数据以 mean ± SEM 表示；采用双尾非配对 Student t 检验。缩写：Acta2，平滑肌 α2 肌动蛋白；NEFA，非酯化脂肪酸；PA，棕榈酸；Pdgfβ，血小板源性生长因子 β 亚基；TC，总胆固醇；TG，甘油三酯；Timp，金属蛋白酶组织抑制因子。

肝细胞特异性过表达 Gpr75 加重饮食诱导的 MASH 和纤维化

为判断肝脏 Gpr75 过表达是否会加重 MASH，作者在小鼠中利用 AAV8 介导肝细胞特异性 Gpr75 过表达。在 6 周 CDAHFD 挑战下，与对照组相比，Gpr75 水平升高使肝脏重量/体重比增加，并加重肝脂肪变性、纤维化和巨噬细胞浸润。这些变化伴随血清 ALT 和 AST 活性升高，以及肝脏 TG、总胆固醇和非酯化脂肪酸水平升高。定量 PCR 分析显示，肝细胞特异性 Gpr75 过表达小鼠中新生脂肪生成、纤维化和炎症相关基因上调，提示肝损伤和炎症反应增强。

随后，作者在 HFD 诱导小鼠模型中进一步考察 Gpr75 过表达的影响。从第 8 周开始，Gpr75 过表达小鼠体重增长显著增加，但食物摄入无明显变化，同时糖代谢稳态受损。Gpr75 过表达可促进更严重的肝脂肪变性和损伤，表现为组织学改变、血清 AST 升高以及肝脏/血清脂质水平升高。该表型与脂肪生成基因表达增强和肝脏游离脂肪酸升高相关。蛋白水平和免疫荧光分析提示，GPR75 可能通过抑制 PKA 磷酸化，上调核内 SREBP-1c，从而促进脂质积累。

总之，与 Gpr75hko 小鼠的表型相反，肝细胞特异性 Gpr75 过表达会加重饮食诱导的脂肪变性、炎症和代谢功能障碍，说明 GPR75 是推动 MASLD/MASH 进展的重要因子。

图4：肝细胞特异性过表达 Gpr75 加重饮食诱导的 MASH 和纤维化。（A）在肝细胞特异性 Gpr75 过表达小鼠中通过 CDAHFD 喂养诱导 MASH 的实验时间线。（B）肝脏重量/体重比（n = 8）。（C）肝组织切片代表性 H&E 和油红 O 染色。比例尺：200 µm（n = 5）。（D）血清 ALT 和 AST 水平（n = 8）。（E）肝脏 TG、TC 和 NEFA 含量（n = 8）。（F）参与脂肪酸（FA）代谢相关基因的 mRNA 表达（n = 7）。（G）通过 Masson 染色和免疫组织化学评估肝纤维化。比例尺：200 µm（n = 5）。（H）α-SMA 和 COL1A1 的相对蛋白表达，并以 GAPDH 归一化（n = 6 个生物学重复/组）。（I）纤维化相关基因的 mRNA 表达（n = 7）。（J）炎症相关基因的 mRNA 表达（n = 7）。所有图中：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，ns 表示无统计学意义。数据以 mean ± SEM 表示；采用双尾非配对 Student t 检验。缩写：FA，脂肪酸；NEFA，非酯化脂肪酸；TC，总胆固醇；TG，甘油三酯。

GPR75 与 GNAI2 相互作用并调控脂肪酸合成

为研究 GPR75 作为 G 蛋白偶联受体是否通过 G 蛋白偶联促进 MASH 进展，作者对 CDAHFD 喂养的对照小鼠和肝脏 Gpr75 敲低小鼠肝脏进行了蛋白质组学分析。Gene Ontology 富集分析显示，催化活性、GTP 结合和过氧化物酶体功能相关通路发生改变。基因集富集分析进一步将 GPR75 与脂肪酸代谢、GTPase 活性和 NF-κB 信号联系起来。更重要的是，火山图分析发现，Gpr75 敲低后抑制性 G 蛋白亚基 Gαi2（由 Gnai2 编码）显著下降。

既往研究提示，在蛋氨酸和胆碱缺乏饮食喂养小鼠中，肝脏 Gnai2 删除可减轻脂肪性肝炎，抑制炎症标志物，并增强脂滴自噬。也有研究显示，Gnai2 转录表达可通过 TLR4-TRAF6 依赖性机制受 NF-κB 上调，形成 GNAI2 与 NF-κB 之间的正反馈环路，从而促进 NASH 中的慢性炎症状态。本研究中，Gpr75 敲低和敲除均降低 GNAI2 的 mRNA 和蛋白表达，而 Gpr75 过表达则升高其表达。为确定 GNAI2 是否与 GPR75 相互作用，作者在 PA 处理的 HepG2 细胞中进行了 Co-IP 实验，证实 GNAI2 与 GPR75 存在相互作用；MASH 小鼠肝脏中二者强烈共定位也支持这一结果。

多数 GPCR 可通过一种或多种 G 蛋白发出信号，并作用于腺苷酸环化酶（AC）、磷脂酶 C、离子通道和 cGMP 磷酸二酯酶等下游效应分子。AC 催化第二信使 cAMP 的合成，cAMP 随后结合 PKA 调节亚基，释放有活性的 PKAc 亚基。作者推测，GNAI2 的募集在 GPR75 加重 MASH 进展的致病作用中具有关键意义，即通过抑制 AC 活性而不是被 AC 抑制。Gpr75 过表达可通过 GNAI2 抑制 PKA 活性，从而调节细胞内信号分子并促进 SREBP-1c 表达；相反，Gpr75 敲除解除对 GNAI2 相关通路的抑制，增强 PKA 磷酸化活性，进而降低 SREBP-1c 水平。

在 HepG2 细胞中，shGPR75 慢病毒感染可降低 SREBP-1c、TG 和 IL-1β 水平，同时增加 PKA 磷酸化。SREBP 家族蛋白，尤其是 SREBP1c 和 SREBP2，是调控肝细胞新生脂肪生成、胆固醇代谢和炎症信号通路的关键核转录因子，参与 MASLD 形成。更重要的是，多项证据表明，PKA 可磷酸化 SREBP-1c，从而减弱其转录活性或调控前体 SREBP-1c 成熟，并提示 PKA 可能通过减少脂质合成发挥作用。GPR75 缺失可显著降低 SREBP-1c 的核转位，以及 SREBP-1c 前体形式和成熟形式。相反，在肝细胞中过表达 GPR75 可有效抑制 PKA 磷酸化，同时增加 SREBP-1c 蛋白水平和 TG 含量；而在慢病毒转导建立的稳定细胞系中，沉默 GNAI2 可削弱这些效应。

为了在体内验证 GPR75 与 GNAI2 的功能关系，作者向小鼠共同给予 AAV-TBG-Gpr75 或 AAV-TBG-Gpr75-shGnai2。Gnai2 敲低可缓解 Gpr75 过表达诱导的肝肿大和肝脂肪变性，表现为肝重降低、H&E 和油红 O 染色提示组织学改善，以及 TG 水平下降。此外，GPR75 对新生脂肪生成相关基因的上调作用也受到抑制。为说明 GNAI2 对 GPR75 介导的肝损伤、炎症和纤维化进展的贡献，作者检测了血清 AST 水平以及 α-SMA 和 F4/80 蛋白水平。结果显示，Gnai2 沉默显著减轻 Gpr75 过表达诱导的严重 MASH 进展。与预期一致，Gpr75 过表达抑制 PKA 活性，导致 PKA 底物磷酸化减少；而 Gnai2 敲低后，GPR75 对 PKA 的这一调控作用被取消。总体来看，数据强烈提示，抑制 Gnai2 可显著减轻 Gpr75 过表达诱导的肝脏炎症和纤维化。

图5：GPR75 与 GNAI2 相互作用并调控脂肪酸合成。（A）GO 富集分析和（B）火山图显示显著富集的信号通路和差异表达蛋白。（C）在 HepG2 细胞中使用抗 Flag 和 GNAI2 抗体进行免疫沉淀（n = 3 个生物学重复/组）。（D）免疫荧光染色显示肝组织切片中 GPR75（绿色）和 GNAI2（红色）共定位（n = 3）。（E）CDAHFD 喂养后，对照组、Gpr75 过表达组、Gpr75fl/fl 组和 Gpr75hko 小鼠肝脏中蛋白水平的免疫印迹分析（n = 3 个生物学重复/组）。（F–H）在转导 LV-C（对照）、LV-GPR75 或 LV-GPR75-siGNAI2 慢病毒载体的 HepG2 细胞中进行分析。（F）p-PKA 和总 PKA 蛋白水平（n = 3 个生物学重复/组）。（G）采用 Nile Red 染色评估脂质积累。（H）细胞内 TG 含量。（I）AAV8-TBG、AAV8-TBG-Gpr75 以及 AAV8-TBG-Gpr75 + AAV8-TBG-shGnai2 共感染小鼠在 CDAHFD 喂养 8 周条件下的实验时间线。（J）肝脏重量/体重比（n = 10）。（K）肝组织切片代表性 H&E、油红 O 和 Masson 三色染色。比例尺：200 µm（n = 5）。（L）肝脏 TG 和 NEFA 水平（n = 10）。（M）p-PKA、PKA 底物磷酸化、总 PKA 和 SREBP-1c 的 Western blot 分析（n = 3 个生物学重复/组）。所有图中：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，ns 表示无统计学意义。数据以 mean ± SEM 表示；E 采用双尾非配对 Student t 检验；F–H、J 和 M 采用单因素方差分析。缩写：GNAI2，鸟嘌呤核苷酸结合蛋白 G(i) α-2 亚基；GO，基因本体；PKA，蛋白激酶 A；SREBP-1c，固醇调节元件结合蛋白 1c；TG，甘油三酯。

VPS35 通过将 GPR75 回收至肝细胞表面维持 GPR75 表达

为解释 MASH 中 GPR75 蛋白水平升高而 mRNA 表达不变这一现象，作者研究了 GPR75 蛋白降解。PA 暴露后，GPR75 降解速率减慢。通过免疫沉淀联合质谱鉴定 GPR75 相互作用蛋白时，作者发现了多个与蛋白降解通路相关的候选蛋白，包括 UBE2N。然而，UBE2N 与 GPR75 之间未发现直接相互作用；使用 UBE2N 抑制剂 NSC697923 处理后，GPR75 泛素化水平也几乎无变化。

GO 生物过程分析显示，囊泡介导转运相关通路显著富集。其中，VPS35 被鉴定出来。VPS35 是 retromer 复合体的核心组分，可介导与待回收分选受体之间的相互作用。值得注意的是，VPS35 与 GPR75 在 HepG2 细胞和 CDAHFD 诱导的小鼠肝脏中均显示明显细胞内共定位。Co-IP 实验也证实 VPS35 与 GPR75 可相互结合，提示 VPS35 可能促进 GPR75 分选并运回细胞膜，而不是进入溶酶体或蛋白酶体降解途径。

无论是否给予 CCL5 刺激，VPS35 沉默均可加速 GPR75 降解，并显著减轻 PA 诱导的肝细胞脂质积累，支持 VPS35 在稳定 GPR75 中具有必要作用。更重要的是，免疫印迹和免疫荧光分析证实，GPR75 上调主要发生在细胞膜，而细胞质中并未显著增加。这进一步表明，VPS35 可促进 GPR75 回收到细胞表面，从而增强其膜定位并减少降解。与此一致，siVPS35 增强了 GPR75 与溶酶体标志物 LAMP1 的共定位。这些结果提示，VPS35 可将 GPR75 分选并回收到质膜，从而维持其高表达和功能活性。

与其致病作用一致，VPS35 在饮食诱导小鼠和 MASH 患者肝脏中均上调。为研究其功能意义，作者使用 AAV8-TBG-shVps35 在 CDAHFD 诱导小鼠中敲低肝脏 Vps35。肝脏 Vps35 缺失可改善 MASH 表型，表现为肝脏重量/体重比下降、TG 和游离脂肪酸水平降低、脂肪生成相关基因表达受抑制，以及组织学改善。同时，Vps35 敲低可阻断 CDAHFD 诱导的肝损伤，显著减少肝脏内 F4/80 阳性巨噬细胞积累，降低肝脏 α-SMA 阳性面积，并改善肝损伤。最重要的是，Vps35 敲低小鼠中 GPR75 蛋白表达显著降低，而转录水平未发生变化。就 GPR75 下游通路而言，Vps35 敲低可激活 PKA 磷酸化，与肝脏 Gpr75 敲低的效应相似。总体而言，这些数据提示，Vps35 敲低可减少 GPR75 运回肝细胞膜，并且 VPS35 表达与 MASH 严重程度呈正相关。

图6：VPS35 通过将 GPR75 回收至肝细胞表面来维持 GPR75 表达。（A）HepG2 细胞在有或无 PA 刺激条件下，随后给予环己酰亚胺（CHX，100 µg/mL）处理 0、2、4 和 6 小时后，GPR75 的相对蛋白表达（n = 3 个生物学重复/组）。（B）IP-MS 实验示意图。（C，D）HepG2 细胞中 GPR75 与 VPS35 相互作用的 Co-IP 分析（n = 2 个生物学重复/组）。（E）荧光成像显示 AML12 细胞中 GPR75 和 VPS35 共定位。（F）HepG2 细胞中 GPR75 的相对蛋白水平（n = 3 个生物学重复/组）。（G）HepG2 细胞中的 TG 含量。（H）HepG2 细胞膜蛋白和胞质蛋白的免疫印迹分析。（I）AML12 细胞中 GPR75 的共聚焦显微镜图像。比例尺：15 µm。（J）GPR75（红色）与 LAMP1（绿色）的共定位分析。比例尺：15 µm。（K）CDAHFD 喂养 8 周小鼠中肝细胞特异性 Vps35 敲低的实验设计。（L）小鼠肝脏重量/体重比（n = 10）。（M）肝组织切片代表性 H&E、油红 O 和 Masson 染色。比例尺：200 µm（n = 5）。（N）肝脏 TG 和 NEFA 水平（n = 10）。（O）肝组织中 VPS35、GPR75、p-PKA、PKA 和 SREBP-1c 的相对蛋白表达（n = 3 个生物学重复/组）。所有图中：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，ns 表示无统计学意义。数据以 mean ± SEM 表示；G–I 采用单因素方差分析；A、F 和 L–O 采用双尾非配对 Student t 检验。缩写：CCL5，C-C 基序趋化因子配体 5；LAMP1，溶酶体相关膜糖蛋白 1；PA，棕榈酸；TG，甘油三酯；VPS35，液泡蛋白分选相关蛋白 35。

肝脏 GPR75 是筛选 MASH 治疗化合物的潜在靶点

基于上述数据，作者利用计算机辅助分子对接（AutoDock 和 MolProphet V1.0）筛选与 GPR75 具有高结合亲和力的化合物，并通过 BODIPY 染色实验进行功能验证。在这些化合物中，X201415（CAS 477252-30-5）因能够以剂量依赖方式强效抑制 HepG2 细胞脂滴积累而被鉴定出来。作者还开展了细胞热转移实验，以评估 GPR75 与 X201415 之间的结合。结果显示，X201415 可提高 GPR75 的热稳定性。删除 GPR75 后，X201415 的保护作用消失，提示 X201415 通过与 GPR75 相互作用来对抗肝细胞脂质积累。

为了评估 X201415 作为新型 MASH 治疗候选物的药理作用，作者在 CDAHFD 诱导的 MASH 小鼠中进行了实验，剂量为 20 mg/kg，每日一次灌胃。结果显示，X201415 可降低体重，组织学上减轻肝脂肪变性，并降低肝脏 TG 水平。同时，该化合物对饮食诱导的肝脏脂质合成、炎症激活和纤维化也表现出一致的保护作用。此外，与溶媒对照相比，治疗组小鼠肝脏中 cAMP-PKA 通路活化增强，SREBP-1c 蛋白水平下降。综合来看，这些结果表明，X201415 通过靶向 GPR75 对 MASH 具有干预效果，也突出了肝脏 GPR75 作为 MASH 治疗靶点的潜力。

图7：肝脏 GPR75 是筛选 MASH 治疗化合物的潜在靶点。（A）化合物 X201415 与 GPR75（绿色）结合的分子对接模型。（B）在 BSA、PA 和 X201415 处理的 HepG2 细胞中，通过 BODIPY 染色评估脂滴含量。（C）细胞热转移实验（CETSA）结合 Western blot 分析评估 X201415 与 GPR75 的结合（n = 3 个生物学重复/组）。（D）HepG2 细胞中的细胞 TG 含量。（E）CDAHFD 喂养 4 周小鼠在最后 2 周每日灌胃给予 20 mg/kg/d X201415 或溶媒（CMC-Na）后的体重和肝脏重量/体重比（CMC-Na 组 n = 6，X201415 组 n = 5）。（F）肝脏和性腺白色脂肪组织（gWAT）的大体外观。（G）肝组织切片代表性 H&E、油红 O 和 Masson 三色染色。比例尺：200 µm（n = 3）。（H）肝脏甘油三酯（TG）和 TC 水平（n = 5–6）。（I–K）脂肪生成相关基因（I）、促炎因子（J）和纤维化相关基因（K）的 mRNA 表达（n = 5）。（L）溶媒组和 X201415 治疗组小鼠肝脏中 p-PKA、总 PKA 和 SREBP-1c 的 Western blot 分析（n = 4 个生物学重复/组）。所有图中：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，ns 表示无统计学意义。数据以 mean ± SEM 表示；B 和 D 采用单因素方差分析；E 和 G–L 采用双尾非配对 Student t 检验。缩写：CMC-Na，羧甲基纤维素钠；SCR，随机序列对照病毒；TC，总胆固醇。

【贡献】★★★★★

总之，本研究发现，在 MASH 状态下，肝脏中 GPR75 蛋白表达显著升高，而不是 mRNA 水平升高。这一现象与 VPS35 的转运功能密切相关；VPS35 在 MASH 小鼠肝脏中可增强 GPR75 蛋白稳定性，并促进其回收到细胞表面。此外，沉默 Vps35 会导致 GPR75 蛋白水平显著下降，并伴随 PKA 磷酸化降低及随后 SREBP-1c 表达受到抑制。重要的是，肝脏 Gpr75 缺失可改善小鼠 MASH，提示其可能是疾病过程中的关键因素。肝脏 Gpr75 缺失可通过 GNAI2-cAMP-PKA 信号通路减少新生脂肪生成，显示出作为 MASH 治疗靶点的潜力。总体而言，这些发现为理解 MASH 的分子机制提供了有价值的线索，并提示了潜在治疗策略的新方向。

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