Phytomedicine (IF=11.3)｜中药复方抗癌机制再验证：CRISPR敲除锁定复方苦参注射液多靶点通路，IL24、CYP1B1与CYP1A1成关键节点！

2026年7月16日，澳大利亚阿德莱德大学Hanyuan Shen、David L. Adelson团队，联合 Zhendong Pharmaceutical 等单位，在Phytomedicine（中科院1区，IF=11.3）在线发表题为 “Target pathway validation for Compound Kushen Injection active against cancer cells” 的研究论文。该文于2026年1月28日投稿，2026年7月7日修回，2026年7月14日接收，目前为 Journal Pre-proof 版本。

复方苦参注射液（Compound Kushen Injection，CKI），又称岩舒注射液，是来源于苦参（Sophora flavescens Aiton）和白土苓（Smilax glabra Roxb）的中药复方制剂，已在中国用于多种癌症的临床辅助治疗。由于中药复方通常包含复杂天然产物混合物，并具有多成分、多靶点、多通路协同作用特点，其具体作用靶点和机制验证一直是研究难点。

该研究延续团队此前的转录组学工作，从4条候选通路中选择8个关键基因，包括细胞周期通路的 CDKN1A、CDC14B，细胞因子-细胞因子受体相互作用通路的 IL1A、IL24，NF-κB 信号通路的 MYD88、NFKB，以及外源物代谢-细胞色素P450通路的 CYP1A1、CYP1B1。研究利用 CRISPR/CAS 技术，在4种肿瘤细胞系中分别敲除这些基因，并观察细胞增殖、克隆形成、迁移、凋亡和细胞周期等表型变化，以及基因缺失后细胞对CKI处理的响应变化。

结果显示，尽管不同细胞系对基因敲除和CKI处理的敏感性存在差异，但多数候选基因敲除会影响CKI的药理效应。IL24 和 CYP1B1 在 CKI 抑制肿瘤细胞迁移中发挥关键作用，CYP1A1 对 CKI 诱导的 G2/M 期细胞周期阻滞十分重要；MYD88 和 NF-κB 敲除则增强CKI效应，提示部分炎症相关信号可能具有细胞适应性保护作用。整体而言，该研究为“中药复方通过多靶点、多通路协同发挥抗肿瘤作用”提供了功能遗传学层面的验证依据。需要注意的是，本研究主要基于体外肿瘤细胞模型，不能直接等同于人体临床疗效。

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【摘 要】

背景：传统中药通常由复杂天然产物混合物构成，并通过多靶点机制发挥作用。因此，其靶点发现和机制验证一直具有挑战性。研究团队此前以复方苦参注射液（Compound Kushen Injection，CKI）为模型药物，利用转录组学方法识别出多条候选通路和多个候选靶基因，推测CKI可能通过这些通路和靶点发挥药理作用。

目的：本研究旨在证明CKI中天然产物成分的不同药理活性涉及多个遗传靶点。

方法：研究从4条候选通路中选择8个关键基因，并利用 CRISPR/CAS 技术在4种细胞系中敲除这些基因，从而验证它们在CKI药理活性中的作用。

结果：不同细胞系对基因敲除的敏感性存在差异，但总体来看，基因敲除可导致多种细胞活动下降。加入CKI后，除 CDKN1A 基因敲除对CKI作用影响较小外，敲除其他基因均在不同实验中显著影响CKI药理效应。其中，MYD88 和 NFkB 基因敲除增强了CKI效应。同时，研究发现 IL24 和 CYP1B1 在CKI抑制肿瘤细胞迁移中发挥关键作用，而 CYP1A1 对CKI诱导的细胞周期阻滞具有重要意义。

结论：这些发现验证了研究团队此前转录组学分析结果，并进一步说明天然产物混合物可通过多靶点协同作用形成复杂药理机制。

关键词：CRISPR/CAS；天然药物；多靶点；癌症治疗；复方苦参注射液。

01

研究背景及科学问题

复方苦参注射液（CKI），又称岩舒注射液，来源于苦参（Sophora flavescens Aiton）和白土苓（Smilax glabra Roxb），是一种依据传统中医药理论制备的中药制剂。CKI 于1995年获中国食品药品监督管理部门批准，并已用于多种癌症的临床治疗。尽管已有相当多临床证据支持CKI的疗效，但由于其传统中药复方组成复杂，其具体作用机制仍未完全明确。

在此前研究中，作者团队将CKI作为传统中药复方模型，采用系统生物学和功能基因组学方法探索其潜在抗癌机制。研究结果提示，CKI可影响大量与癌症治疗相关的基因和通路。这些发现支持CKI可能通过多靶点协同方式发挥作用，而这也正是传统中药的重要特点。然而，尽管团队已经确认CKI能够扰动特定基因及其蛋白产物，但大多数已识别基因和通路仍需要进一步功能验证。

基于此前转录组学结果，研究团队确定了4条受CKI显著影响、并与癌症生物学密切相关的通路。随后，在每条通路中选择2个靶基因进行敲除，以验证其作用。这些基因之所以被选中，是因为它们在CKI处理后出现明显转录变化，并且在各自通路中处于功能上较重要的节点。研究关注的基因包括：细胞周期通路中的 CDKN1A 和 CDC14B；细胞因子-细胞因子受体相互作用通路中的 IL1A 和 IL24；NF-κB 信号通路中的 MYD88 和 NFKB；以及外源物代谢-细胞色素P450通路中的 CYP1A1 和 CYP1B1。

值得注意的是，除 MYD88 外，其余基因在CKI处理后的 MDA-MB-231 和 HepG2 细胞系中均显著上调。这说明CKI对这些基因表达具有明显影响，尤其是在这些癌细胞背景下。为比较物种差异并为未来体内实验做准备，研究在4种细胞系中开展基因敲除：人源 MDA-MB-231 和 A431 细胞，以及小鼠来源 B16F1 和 E0771 细胞。MDA-MB-231 和 A431 细胞曾用于作者此前的转录组学分析，也代表CKI具有临床应用背景的肿瘤类型；B16F1 和 E0771 则作为相应小鼠肿瘤细胞系，用于比较人源和小鼠肿瘤细胞对CKI的反应，并支持未来体内验证研究。

在癌症生物学领域，CRISPR/CAS 技术已被广泛用于探索肿瘤发生、进展和治疗反应的遗传基础。此外，CRISPR/CAS 也常用于研究多种癌症中的药物耐受，包括化疗、靶向治疗和抑制剂治疗相关耐药。本研究将 CRISPR/CAS 技术用于验证候选基因和候选通路在CKI抗癌效应中的功能作用，并进一步探索其对CKI多靶点机制的贡献。研究团队在4种不同细胞系中分别建立8个候选基因的单基因敲除细胞株，观察由此产生的表型变化及其对CKI处理的响应。结果显示，不同细胞系之间存在明显差异；但总体而言，这些基因敲除主要抑制细胞功能，并影响CKI作用。上述结果进一步验证了此前转录组学数据，并强调CKI的抗癌效应可能是通过扰动多条通路和多个靶点的协同作用实现的。

02

重要发现及亮点

CKI的化学特征确认

在开展生物学实验前，研究首先利用 HPLC–UV 对本批次CKI进行化学表征。研究共鉴定并定量8种代表CKI两味组成药材的标志性化合物。这些化合物被选为质控标志物，是因为它们属于CKI已报道的主要生物活性成分，并常用于该制剂质量控制。

其中，菝葜皂苷元苷（macrozamin）被鉴定为白土苓（Smilax glabra，Baituling）的特征成分；苦参碱（matrine）、槐果碱（sophocarpine）、槐定碱（sophoridine）、氧化槐果碱（oxysophocarpine）、氧化苦参碱（oxymatrine）、piscidic acid 和 trifolirhizin 则是苦参（Sophora flavescens，Kushen）的代表性成分。整体来看，这些标志物确认了本研究所用CKI批次具有典型化学指纹图谱和批次一致性。

图1：复方苦参注射液的 HPLC–UV 色谱图。图中标记峰均使用经认证的标准品进行鉴定和定量。

利用外显子缺失法制备基因敲除细胞株

传统 CRISPR-Cas9 基因敲除方法通常在目标基因外显子中删除约20 bp片段，从而引起移码突变并使基因完全失活。然而，由于外显子长度不同、不同剪接异构体存在差异，选择合适的删除片段有时并不容易。

本研究使用 pDG458 质粒，该质粒含有两个独立外源DNA整合位点，可同时导入两条向导序列。针对每个目标基因，研究在目标外显子两侧设计向导序列，以诱导整个外显子从基因组中完全脱落，并在下游外显子中造成移码突变，从而完全失活目标基因。由于删除片段较长，研究也更容易通过PCR进行初筛，再结合Sanger测序和Western blot确认敲除结果。由于 A431 细胞对CKI表现出最稳定、可重复的响应，因此研究将A431细胞用于更详细的机制分析，同时将其余细胞系用于评估不同肿瘤模型中的基因型依赖性反应。

A431细胞中基因敲除后的表型变化

为确定基因敲除对不同细胞活动的影响，研究在A431细胞系中依次检测了细胞活力、克隆形成、细胞周期分布和细胞迁移表型。

在A431细胞的 CCK8 细胞活力实验中，24小时后的细胞增殖比例显示，敲除 IL1A、IL24 和 NFkB 基因可显著降低A431细胞增殖活性；相反，MYD88 基因敲除增强了细胞增殖。克隆形成实验显示，敲除 CDC14B、IL24、NFkB 和 CYP1B1 基因可显著降低单个细胞形成克隆的能力，其中 IL24 和 NFkB 敲除细胞株下降尤其明显，在固定染色后的六孔板图像中可清楚观察到。另一方面，CYP1A1 基因敲除显著增强了克隆形成能力。

细胞周期分析显示，除 CDKN1A 外，其余基因敲除均显著增加凋亡细胞比例，其中 IL24、NFkB 和 CDC14B 敲除细胞株增加更为明显，这与细胞活力实验结果一致。不同细胞周期阶段的比例也提示，像 IL24 敲除这类凋亡增加的基因型，其G1期细胞减少、G2/M期细胞增加，提示可能出现细胞周期阻滞。

在细胞迁移实验中，A431细胞迁移效率较高，几乎可在24小时内完全覆盖创面区域。与野生型细胞相比，多数基因敲除细胞迁移速度略有增加或影响很小；但 CYP1A1 敲除明显降低细胞迁移速度。

图2：A431细胞基因敲除流程及表型表征。（a）使用 pDG458 质粒进行基因敲除的流程。（b）WT 和基因敲除 A431 细胞的细胞活力实验。（c 和 d）比较 WT 与基因敲除 A431 细胞系的克隆形成实验。（e）比较 WT 与基因敲除 A431 细胞系的划痕愈合迁移实验。（f 和 g）比较 WT 与基因敲除 A431 细胞系的流式细胞术细胞周期分析。

不同基因缺失影响A431细胞对CKI的响应

为测试不同基因缺失对CKI作用的影响，研究首先使用 CCK8 实验评估不同CKI浓度下A431基因敲除细胞株的细胞活力。结果显示，在A431细胞系中，几乎所有敲除细胞株在CKI处理后均与野生型细胞存在显著差异，并且随着CKI暴露时间延长、浓度升高，这种差异更加明显。

多数敲除细胞株表现为CKI作用减弱，说明这些基因的功能或其相关产物可能参与介导CKI效应。然而，MYD88 和 NFkB 缺失后，细胞对CKI的响应增强，提示这些基因可能在一定程度上抑制CKI作用。值得注意的是，没有任何单个基因敲除能够完全逆转CKI效应，这进一步符合CKI作为复杂天然产物混合物的多靶点协同作用特征。

作者此前研究发现，CKI可显著降低肿瘤细胞迁移率。因此，本研究进一步比较了不同基因敲除细胞中CKI对细胞迁移的影响。在A431细胞系中，不同基因敲除细胞在CKI处理组和对照组之间的创面愈合率比较显示，CKI可显著降低细胞迁移速度。然而，在 IL24 和 CYP1B1 基因敲除细胞中，这种差异几乎消失，提示这两个基因对于CKI抑制A431细胞迁移十分重要。该现象在A431和MDA-MB-231细胞中 CYP1B1 敲除后的迁移实验图像比较中也可清楚观察到。

进一步比较不同基因型中对照组与CKI处理组迁移速度差异显示，MYD88 和 NFkB 敲除增强了CKI对细胞迁移的抑制作用；而除 CDKN1A 外，其他基因敲除均显著削弱CKI效应。

图3：基因敲除对CKI在A431细胞中药效的影响。（a）CKI处理下的细胞活力实验，左图为24小时，右图为48小时。不同柱表示CKI处理组相对于对照组的比例。（b 和 c）CKI处理下的划痕愈合迁移实验及迁移抑制定量。（d 和 e）A431 和 MDA-MB-231 细胞系中 CYP1B1 敲除迁移实验图像。

MDA-MB-231、E0771和B16F1细胞中基因敲除后的表型变化

为比较不同肿瘤模型中的基因型依赖性表型响应，研究在 MDA-MB-231、B16F1 和 E0771 细胞中开展了相同检测。与A431细胞类似，基因敲除会改变多种细胞表型，但影响程度在不同细胞系之间存在差异。

在 MDA-MB-231 细胞中，敲除细胞周期通路相关基因 CDKN1A 和 CDC14B 可显著减少细胞克隆形成数量。CYP1A1 和 CYP1B1 基因敲除则导致细胞生长和迁移率下降。在生长速度快、迁移率低的 B16F1 细胞中，基因敲除对细胞表型影响相对较小。MYD88 基因敲除显著增强 B16F1 细胞的克隆形成能力，而 CYP1B1 基因敲除则加快细胞生长和迁移。由于 E0771 细胞贴壁不完全，不适合开展需要洗涤和染色步骤的克隆形成实验。不过，一个有趣发现是，8个基因全部敲除均显著降低 E0771 细胞的迁移效率。

基于所有表型结果，研究绘制热图总结各细胞系敲除株的表型变化。总体来看，在多数情况下，这些基因敲除倾向于削弱细胞活性。B16F1 细胞对基因缺失的敏感性似乎较低，而 E0771 细胞的迁移能力受基因敲除影响显著。值得注意的是，MYD88 缺失在多个表型层面上会增强细胞活性。

图4：MDA-MB-231、B16F1 和 E0771 细胞基因敲除后的表型变化。（a 和 b）比较 WT 与基因敲除 MDA-MB-231 和 B16F1 细胞系的克隆形成实验。（c、d 和 e）比较 WT 与基因敲除 MDA-MB-231、B16F1 和 E0771 细胞系的细胞活力。（f、g 和 h）比较 WT 与基因敲除 MDA-MB-231、B16F1 和 E0771 细胞系的细胞迁移实验。（i）不同细胞系相对于 WT 的表型变化热图。

不同基因缺失影响MDA-MB-231、E0771和B16F1细胞对CKI的响应

研究进一步在其余3种细胞系中开展细胞增殖和迁移实验。结果显示，与A431相比，这些细胞系在基因敲除后对CKI响应差异不那么明显。多数基因敲除细胞株表现为CKI活性降低；例外情况是B16F1细胞中 CYP1B1 基因敲除，以及E0771细胞中 IL1A 基因敲除，这两种情况下细胞对CKI响应增强。细胞活力实验热图进一步显示，多数基因敲除株均表现为CKI效应减弱。这种变化在A431细胞中更明显，而 MDA-MB-231 和 B16F1 细胞在基因敲除后对CKI响应变化较小。此外，CYP1A1 和 CYP1B1 基因缺失可改变各细胞系对CKI的响应。

CKI降低 MDA-MB-231 和 B16F1 细胞迁移速度的作用不如A431细胞明显，但仍可观察到多数基因缺失会削弱CKI作用。在 MDA-MB-231 细胞中，与A431类似，IL24 和 CYP1B1 敲除显著影响CKI效应，而 CYP1A1 敲除则增强CKI作用。在 B16F1 细胞中，除 IL24 和 MYD88 敲除增强CKI对细胞迁移的抑制作用外，其他基因缺失通常削弱CKI作用。E0771 细胞的结果较为特殊，多个基因敲除细胞在CKI处理后表现为迁移效率增加。由于该细胞系贴壁较松，实验中可观察到CKI处理样本中漂浮细胞和细胞团明显增加。因此，这种表观迁移增加可能源于漂浮细胞重新附着于创面区域，从而造成类似迁移的假象，实际上可能只是随机分散。作者认为，未来应采用三维细胞迁移实验进一步排除这一影响。

图5：基因敲除对CKI在 MDA-MB-231、B16F1 和 E0771 细胞中药效的影响。（a、b 和 c）MDA-MB-231、B16F1 和 E0771 细胞系在CKI处理下的细胞活力实验，上方为24小时，下方为48小时。不同柱表示CKI处理组相对于对照组的比例。（d、e 和 f）MDA-MB-231、B16F1 和 E0771 细胞系在CKI处理下的划痕愈合迁移实验，上方为实验结果，下方为迁移抑制定量。

CKI处理后的细胞周期响应

基于细胞增殖和迁移实验结果，研究选择A431细胞系全部基因敲除株，以及其他细胞系中对CKI处理较敏感的 CYP1A1 和 CYP1B1 敲除株，进行碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色实验，以分析细胞周期变化。

A431细胞各基因敲除株在对照条件下细胞周期曲线形态差异较小；但在CKI作用下，不同敲除株之间出现明显差异。除凋亡细胞比例存在显著差异外，整体细胞周期谱也出现显著变化，尤其体现在G2/M期细胞比例上。例如，CDKN1A 敲除株与 CYP1A1 敲除株比较显示，细胞发生G2/M期阻滞。

研究进一步汇总CKI处理下不同基因敲除株中凋亡细胞比例和G2/M期细胞比例变化。结果显示，在A431细胞中，MYD88 和 CYP1B1 基因敲除显著增强CKI作用，而其他基因敲除通常削弱CKI作用。其他细胞系中 CYP1A1 和 CYP1B1 敲除株在CKI处理后的凋亡比例和G2/M期比例变化，也与细胞活力实验结果一致。

此外，研究将细胞周期结果与细胞活力实验结果进行比较。在A431细胞中，CDKN1A 敲除影响最小，而 MYD88 和 NFkB 缺失在多个方面增强CKI效应。其余基因敲除则导致CKI效应下降。在另外3种细胞系中，CYP1A1 敲除降低CKI有效性；CYP1B1 功能缺失在B16F1细胞中增强CKI作用，但在另外两种细胞系中降低CKI作用。整体而言，细胞周期分析结果与细胞活力实验结果一致，并提示敲除多数候选基因往往会降低CKI效应。

图6：WT 和基因敲除 A431 细胞系在未处理条件下左侧或CKI处理48小时右侧的代表性流式细胞术细胞周期直方图。

图7：细胞活力实验和细胞周期分析总结，显示不同基因型对CKI响应的影响。（a）不同基因型相对于WT细胞在细胞活力实验中CKI效应变化的热图。（b）不同A431基因敲除细胞系在CKI处理下凋亡率的倍数变化。（c）不同A431基因敲除细胞系在CKI处理下G2/M期比例的倍数变化。（d）与WT相比，MDA-MB-231、B16F1 和 E0771 细胞中 CYP1A1 和 CYP1B1 敲除后，CKI处理下凋亡率和G2/M期比例的倍数变化。

候选基因和相关信号通路共同影响CKI响应

综合来看，研究使用外显子缺失法在4种不同细胞系中成功建立8个基因的敲除细胞株，并通过多种实验阐明其表型变化。进一步通过观察不同基因敲除后CKI效应如何改变，研究验证了这些候选基因及其相关信号通路对细胞响应CKI具有重要影响。

不过，需要注意的是，任何单个基因敲除都无法完全抵消CKI的药理作用。这一结果再次强调，包括中药复方在内的复杂天然产物混合物，其作用机制往往并非依赖单一靶点，而更可能来自多靶点、多通路的协同扰动。

【贡献】★★★★★

本研究基于此前转录组学分析结果，聚焦4条通路中的8个关键基因，并在4种不同细胞系中建立了相应基因敲除模型。实验结果显示，多数候选基因敲除均会显著影响CKI的药理效应，从而验证了早期基因分析结果，也支持传统中药复杂成分多靶点协同作用的机制假说。

此外，研究发现 IL24 和 CYP1B1 基因在CKI抑制细胞迁移中似乎具有关键作用，而 CYP1A1 对CKI诱导G2/M期细胞周期阻滞十分重要。结果显示，敲除这些基因几乎可完全抵消CKI在相应表型上的作用，因此为后续针对特定癌症类型设计治疗策略提供了有价值的研究起点。

总体而言，该研究展示了CKI药理作用的多通路特征，并强调将转录组学与功能遗传学方法结合，用于解析复杂天然产物制剂作用机制的价值。需要强调的是，当前结果主要来自体外肿瘤细胞模型；CKI在不同癌种、不同组织环境以及体内免疫系统参与下的作用，仍需要进一步通过更复杂生物系统和体内实验进行验证。

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