Cell Commun Signal (IF=11.6)｜活性蛋白质组学锁定DNJ新靶点：直接作用ATP5F1，缓解高糖诱导的心肌细胞线粒体损伤！(杨美娜团队)

2026年7月20日，山东第一医科大学附属第一医院/山东省千佛山医院、山东第一医科大学生物医学科学学院、山东中医药大学等单位，在Cell Communication and Signaling（中科院2区，IF=11.6）发表题为 “Activity-based proteomics analysis revealed that DNJ directly targeted ATP5F1 to alleviate high glucose induced cardiomyocyte injury” 的研究论文。该文于2026年1月6日投稿，2026年7月11日接收，通讯作者为杨美娜。

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是糖尿病的重要心血管并发症，其特点包括心功能受损和线粒体损伤。1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）是一种来源于桑叶的天然生物碱，既往主要因其α-葡萄糖苷酶抑制和降糖作用受到关注，但近年来研究提示其可能具有独立于降糖之外的心肌保护潜力。本文利用活性蛋白质组学分析（activity-based protein profiling，ABPP），筛选并验证DNJ在心肌细胞中的直接作用靶点，最终发现线粒体F0复合物亚基B1（ATP5F1）是DNJ的主要结合靶点。

研究显示，DNJ与ATP5F1之间存在高亲和力相互作用，表面等离子体共振（surface plasmon resonance，SPR）测得解离常数Kd为52.6 nM，细胞热转变实验（cellular thermal shift assay，CETSA）进一步证明该结合可发生于活细胞内。在高糖诱导的H9c2心肌细胞损伤模型中，DNJ可改善线粒体功能障碍、氧化应激和细胞凋亡；敲低ATP5F1会削弱DNJ的保护作用，而过表达ATP5F1则增强相关保护效应。该研究为DNJ干预糖尿病心肌病提供了新的分子机制线索，也提示ATP5F1可能成为代谢性心肌病干预的新靶点。

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【摘 要】

背景

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是糖尿病的重要并发症，其特征包括心功能受损和线粒体损伤。天然生物碱1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）已显示出心肌保护潜力；然而，其在心肌细胞中的具体分子靶点仍有待明确。

目的

本研究旨在发现DNJ在心肌细胞中的直接作用靶点，并阐明其发挥心肌保护作用的分子机制。

方法

研究首先建立高糖诱导的心肌细胞损伤模型。随后，采用活性蛋白质组学分析（activity-based protein profiling，ABPP）筛选可与DNJ直接结合的蛋白。DNJ与候选靶点之间的相互作用通过表面等离子体共振（SPR）、细胞热转变实验（CETSA）和分子对接进行验证。最后，通过小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）敲低和质粒过表达实验验证其功能效应。

结果

ABPP筛选鉴定出线粒体F0复合物亚基B1（ATP5F1）是DNJ的主要结合靶点。SPR分析证实DNJ与ATP5F1之间存在高亲和力相互作用，Kd值为52.6 nM。进一步的CETSA结果表明，这种结合可在活细胞内发生。DNJ处理（120 μg/mL）可显著改善高糖诱导的线粒体功能障碍、氧化应激和细胞凋亡。通过siRNA敲低ATP5F1会削弱DNJ的保护作用；相反，ATP5F1过表达可增强这些保护效应。

结论

本研究首次鉴定ATP5F1为DNJ的直接功能靶点。DNJ可通过直接作用于ATP5F1，减轻线粒体功能异常、氧化应激和细胞凋亡，从而发挥心肌保护作用。这些发现共同阐明了DNJ的一种新作用模式，并为其在DCM中的潜在治疗应用提供了科学依据。

01

研究背景及科学问题

糖尿病心肌病是糖尿病的一种严重心血管后果。其特征是在没有明显冠状动脉疾病的情况下，心脏结构和功能发生进行性异常，最终可导致心力衰竭。尽管现有降糖药物能够有效控制全身高血糖，但临床上仍迫切需要能够特异性作用于心肌细胞、纠正其内在代谢失衡的治疗策略，以预防或逆转DCM进程。

DNJ是一种从桑叶中提取的天然生物碱，传统上因其α-葡萄糖苷酶抑制活性和降糖作用而受到关注。然而，越来越多证据表明，DNJ的治疗潜力并不局限于血糖调节。有研究显示，DNJ可通过调节蛋白N-糖基化减轻糖尿病动物早期心脏纤维化；也有研究证明其可靶向OPA1，促进线粒体嵴重塑，从而缓解与线粒体功能障碍相关的心肌肥厚。此外，DNJ在DCM小鼠模型中可显著改善心功能并减少纤维化；其还被证实可通过抑制JAK2/STAT6信号通路，对脓毒症诱导的心脏损伤发挥保护作用。这些研究共同提示，DNJ可能是DCM治疗的一个有潜力的候选分子。然而，DNJ在心肌细胞中的具体分子靶点及其精确的心肌保护机制仍不清楚。

ABPP是一种非常适合用于解决这一问题的有效工具。该方法利用功能化小分子探针，在更接近生理状态的环境中直接、相对无偏地识别与其相关的活性蛋白，因此尤其适用于发现天然产物的作用靶点。例如，ABPP曾帮助研究者发现小檗碱可通过靶向IRGM1阻断PI3K/AKT/mTOR通路，从而缓解溃疡性结肠炎；该方法还鉴定AKR7A2为甘草酸的直接靶点，并阐明其抗肝纤维化机制。

本研究发现，DNJ可显著保护心肌细胞免受高糖诱导损伤。此外，作者利用ABPP鉴定了其背后的分子过程。总体而言，本研究为理解DNJ功能提供了新的机制认识，并提示了DCM治疗的潜在靶点。

02

重要发现及亮点

ABPP蛋白质组学分析确认ATP5F1是DNJ的靶蛋白

为建立DCM细胞模型，研究者首先用不同浓度葡萄糖（25–150 mmol/L）处理H9c2心肌细胞。结果显示，当葡萄糖浓度达到50 mmol/L时，细胞活力较对照组显著降低，并随着葡萄糖浓度升高呈剂量依赖性下降。其中，75 mmol/L葡萄糖能够诱导稳定且可重复的细胞损伤，因此被选为后续模型构建浓度。

在高糖环境下，研究者进一步检测不同浓度DNJ（0–480 μg/mL）对细胞活力的影响。随着DNJ浓度升高，严重葡萄糖损伤细胞的活力逐渐改善，其中120–240 μg/mL时恢复作用最明显，而480 μg/mL时保护作用下降。为排除DNJ本身的细胞毒性，作者在正常葡萄糖条件下单独给予DNJ。结果显示，120 μg/mL DNJ对正常葡萄糖条件下细胞活力无明显影响，而480 μg/mL DNJ会降低细胞活力。在高糖条件下，120 μg/mL DNJ可显著提高细胞活力，而480 μg/mL效果较弱。综上，DNJ在低剂量下具有较好的安全性和保护作用，高剂量则可能产生细胞毒性。因此，研究者将120 μg/mL确定为后续实验工作浓度。

随后，研究者采用ABPP明确DNJ的直接靶点。基于DNJ母核结构，作者设计并合成了一种功能化探针（DNJ-probe）：该探针带有末端炔醇基团，可通过点击化学进行生物素连接；同时带有光响应性双茚基团，可在紫外照射下与靶蛋白发生共价交联。值得注意的是，DNJ-probe表现出与DNJ相近的生物活性，说明这一结构修饰没有影响其药理效应。

ABPP流程如下：在高糖条件下培养H9c2细胞并加入DNJ探针，随后用紫外光照射，使探针与相互作用蛋白发生共价交联。细胞裂解后，通过点击化学将生物素标签引入探针标记的蛋白复合物，再用链霉亲和素磁珠高效富集。经严格洗涤去除非特异性结合后，靶蛋白复合物经胰蛋白酶消化，最后采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行鉴定和定量。结果显示，DNJ探针的荧光强度随浓度升高而增强；当浓度为800 μM时，蛋白条带可见且荧光强度合适，因此该浓度被选为DNJ探针的最佳工作浓度。在竞争实验中，游离DNJ以剂量依赖方式降低探针标记信号，从而验证了探针标记的特异性。

比较探针标记组和游离DNJ竞争组的蛋白质组学结果后，研究者鉴定出一批具有优先结合特征的候选蛋白。其中，ATP合酶F0复合物亚基B1（ATP5F1）具有最高富集倍数和显著竞争抑制效应，因此被选为后续功能验证的关键靶点。

图1：ABPP方法联合LC-MS/MS用于分析鉴定DNJ的靶点。A. 不同浓度葡萄糖对H9c2心肌细胞活力的影响（n=5，**p < 0.01，***p < 0.001）。B. 不同浓度DNJ对H9c2心肌细胞活力的影响（n=5，**p < 0.01， < 0.05，# < 0.01）。C. 正常葡萄糖和高糖条件下，不同浓度DNJ对细胞活力的影响（n=5，***p < 0.001，# < 0.01）。D. DNJ-Probe对H9c2心肌细胞的细胞毒性检测（n=6）。E. DNJ探针的分子结构。F. H9c2细胞中基于ABPP的DNJ蛋白靶点筛选流程。G. DNJ-P在H9c2心肌细胞中的剂量依赖性原位蛋白标记。H. DNJ与DNJ-probe竞争原位蛋白标记。I. 柱状图显示DNJ-probe组与“competition”组之间所选靶蛋白富集水平差异，每个点代表DNJ-probe组与competition组的比值（均值±标准差，n=3）。

DNJ直接靶向并调控H9c2心肌细胞中的ATP5F1

为确认DNJ与ATP5F1在具有生理相关性的细胞环境中是否存在直接相互作用，研究者首先进行了CETSA。与对照组心肌细胞相比，DNJ处理组心肌细胞中ATP5F1表现出更高的熔解温度，说明DNJ可在活细胞中结合ATP5F1并稳定其构象。随后，研究者采用SPR技术测定DNJ与重组ATP5F1蛋白的体外结合亲和力。结果显示，DNJ与ATP5F1存在直接相互作用，平衡解离常数Kd为52.6 nM，提示二者具有较高结合亲和力。

分子对接模拟进一步显示，DNJ可与ATP5F1蛋白上的Leu88、Glu91和Ile95等关键氨基酸残基形成氢键，从而稳定结合于ATP5F1的疏水口袋中，计算得到的结合自由能为-32.49 kcal/mol。最后，在高糖诱导损伤的H9c2细胞模型中，作者检测了不同浓度DNJ对ATP5F1蛋白表达水平的影响。结果显示，高糖处理显著降低细胞内ATP5F1蛋白水平，而DNJ处理可逆转这一趋势，其中120 μg/mL浓度改善作用最明显。

图2：DNJ与ATP5F1之间的直接相互作用。A和B：通过CETSA-WB验证DNJ与ATP5F1之间的相互作用。C：采用SPR实验评估DNJ与ATP5F1之间的亲和力。D：DNJ与ATP5F1的分子对接。E和F：Western blot分析HG和DNJ处理24 h后H9c2细胞中ATP5F1表达（n=3，*p < 0.05）。

敲低ATP5F1可抑制DNJ对心肌细胞线粒体功能障碍的改善作用

为研究DNJ对高糖诱导H9c2心肌细胞损伤的影响，研究者设计了4条靶向ATP5F1的siRNA序列（si-ATP5F1-1～4），并在转染H9c2心肌细胞后筛选敲低效率最高的序列。结果显示，si-ATP5F1-4在mRNA和蛋白水平均表现出最显著的敲低效果。因此，后续实验采用si-ATP5F1-4作为ATP5F1敲低序列，以NC siRNA转染组作为阴性对照。CCK-8结果显示，与DNJ处理组相比，敲低ATP5F1会降低DNJ促进细胞存活的作用，使细胞活力接近高糖组水平。

随后的线粒体功能和结构研究显示，DNJ可抵消高糖诱导的线粒体膜电位下降，而ATP5F1抑制会取消这一作用。同时，DNJ改善高糖条件下细胞内ATP水平下降的作用同样依赖ATP5F1表达。MitoTracker Red染色的形态学观察显示，在高糖条件下DNJ可维持网状线粒体网络；相比之下，ATP5F1敲低细胞中的线粒体出现碎片化，且DNJ无法缓解这一改变。透射电子显微镜结果进一步显示，DNJ可保护线粒体嵴结构并减少其扩张，而这一保护作用在ATP5F1敲低细胞中未被观察到。

图3：敲低ATP5F1可取消DNJ对H9c2心肌细胞线粒体功能障碍的改善作用。A、B和C：验证H9c2细胞中ATP5F1敲低效率（n=3，**p < 0.01，***p < 0.001）。D：五组H9c2细胞的细胞活力检测（n=3，***p < 0.001）。E：不同组ATP生成的半定量分析（n=3，*p < 0.05，***p < 0.001）。F：红/绿荧光比值的定量结果（n=3，***p < 0.001）。G：采用JC-1染色检测不同组的线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）（比例尺100 µm）。H：五组H9c2细胞的MitoTracker Red染色（比例尺100 µm）。I：五组H9c2细胞的代表性透射电子显微镜图像（比例尺500 nm）。

敲低ATP5F1可抑制DNJ对心肌细胞氧化应激和凋亡的改善作用

线粒体功能障碍是细胞氧化应激的重要触发因素。为进一步明确DNJ的抗氧化作用是否依赖ATP5F1，研究者检测了细胞氧化还原状态。DCFH-DA染色结果显示，高糖刺激导致细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）显著积累；DNJ干预可降低ROS水平，而敲低ATP5F1可逆转这一保护作用。研究者还采用线粒体特异性SOX染色检测线粒体来源ROS，其变化趋势与总ROS检测结果一致。随后，作者利用生化试剂盒检测氧化应激关键指标，发现高糖处理可升高细胞内丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平，并降低超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）活性。DNJ处理可改善这些变化，但敲低ATP5F1后，DNJ的抗氧化作用被抑制。

持续氧化应激是细胞凋亡的重要信号。基于此，研究者进一步探讨DNJ是否通过ATP5F1抑制高糖诱导的心肌细胞凋亡。首先，作者采用Annexin V/PI双染流式细胞术进行定量分析。结果显示，DNJ组细胞总凋亡率低于高糖组；然而，敲低ATP5F1后，DNJ的抗凋亡作用减弱。TUNEL染色进一步验证了这一观察：DNJ可减少高糖诱导的DNA断裂阳性细胞，而在ATP5F1敲低细胞中未见同样效果。

为阐明其分子过程，研究者通过Western blot检测凋亡级联反应中的关键调控蛋白。结果显示，在高糖环境下，抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降，促凋亡蛋白Bax和活化Caspase-3水平升高，同时线粒体细胞色素c（cytochrome c，Cyto-c）向细胞质释放增加。DNJ可逆转这些蛋白表达变化；然而，在ATP5F1敲低细胞中，DNJ不能显著改变这些蛋白水平。总体而言，这些数据表明，ATP5F1对DNJ发挥抗高糖诱导线粒体功能障碍、氧化应激和心肌细胞凋亡的保护作用是必要的。

图4：敲低ATP5F1可取消DNJ对H9c2心肌细胞氧化应激和凋亡的改善作用。A和C：各组细胞ROS水平的荧光染色及定量统计分析（比例尺10 µm，n=3，***p < 0.001）。B和D：各组线粒体ROS水平的线粒体染色及定量统计分析（比例尺100 µm，n=3，***p < 0.001）。E–G：心肌细胞中MDA、SOD和GSH的表达/水平（n=8，***p < 0.001）。H和I：采用Annexin V-FITC/PI流式细胞术和TUNEL染色检测细胞凋亡（比例尺100 µm）。J：TUNEL阳性细胞百分比的定量柱状图（n=3，***p < 0.001）。K–O：Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3以及细胞质/线粒体细胞色素c（Cyto-c）的蛋白表达水平，并进行灰度定量分析（n=3，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001）。

过表达ATP5F1可改善H9c2心肌细胞线粒体功能障碍

为验证ATP5F1在DNJ心肌保护作用中的功能重要性，研究者构建了ATP5F1过表达H9c2心肌细胞模型。首先，在高糖条件下评估细胞活力。结果显示，与空载体对照组相比，单独过表达ATP5F1可显著缓解高糖诱导的细胞活力下降，提示增强ATP5F1功能本身具有保护作用。值得注意的是，ATP5F1过表达联合DNJ可将细胞活力恢复至最高水平，提示二者可能具有协同保护效应。

MitoTracker Red染色显示，ATP5F1过表达可明显改善高糖导致的线粒体形态损伤，并恢复线粒体网络结构。通过JC-1染色检测线粒体膜电位后发现，ATP5F1过表达可有效恢复高糖导致的膜电位下降，并与DNJ产生协同作用。此外，ATP5F1过表达还能抵消高糖诱导的细胞内ATP水平下降，这与ATP5F1作为ATP合酶亚基的功能一致。

图5：ATP5F1过表达可改善H9c2心肌细胞线粒体功能障碍。A–C：验证H9c2细胞中ATP5F1过表达效率（n=3，**p < 0.01，***p < 0.001）。D：五组H9c2细胞的细胞活力（n=3，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001）。E和F：通过JC-1染色检测不同组的MMP，并进行半定量分析（比例尺100 µm，n=3，*p < 0.05，***p < 0.001）。G：五组H9c2细胞的MitoTracker Red染色（比例尺100 µm）。H：不同组ATP生成的半定量分析（n=3，*p < 0.05，***p < 0.001）。

过表达ATP5F1可改善H9c2心肌细胞氧化应激和凋亡

考虑到线粒体功能障碍常常先于氧化应激和凋亡发生，研究者进一步评估ATP5F1表达升高对这两个关键致病过程的影响。在高糖环境下，ATP5F1过表达可减少总ROS和线粒体ROS积累，降低MDA水平，并提高SOD和GSH水平。这表明ATP5F1过表达能够改善高糖诱导的氧化应激状态。上述改善作用与DNJ处理组相似，提示ATP5F1过表达具有类似的抗氧化效应。

在有效缓解氧化应激的基础上，研究者进一步分析了细胞凋亡这一终末事件。结果显示，ATP5F1过表达可显著减少高糖诱导的心肌细胞凋亡。流式细胞术检测到的凋亡率以及TUNEL阳性细胞数量均显著下降，其抗凋亡效果与DNJ组相比没有显著差异。

凋亡通路蛋白检测结果显示，ATP5F1过表达在高糖条件下具有显著抗凋亡作用。Western blot结果表明，与转染OE-NC的对照组相比，ATP5F1过表达显著上调抗凋亡蛋白Bcl-2表达，同时下调促凋亡蛋白Bax和Cleaved caspase-3水平。此外，通过分离细胞质和线粒体组分检测Cyto-c分布发现，ATP5F1过表达可有效抑制Cyto-c从线粒体释放至细胞质。

综合干扰和过表达实验结果，作者认为ATP5F1对于DNJ保护作用既是必要的，也是足以介导相关保护效应的重要因素。因此，ATP5F1可被视为协调改善线粒体功能、氧化应激和细胞死亡的关键靶点。

图6：ATP5F1过表达可改善H9c2心肌细胞氧化应激和凋亡。A和C：各组细胞ROS水平的荧光染色及定量统计分析（比例尺10 µm，n=3，***p < 0.001）。B和D：各组线粒体ROS水平的线粒体染色及定量统计分析（比例尺100 µm，n=3，***p < 0.001）。E–G：心肌细胞中MDA、SOD和GSH的表达/水平（n=8，***p < 0.001）。H和I：采用Annexin V-FITC/PI流式细胞术和TUNEL染色检测细胞凋亡（比例尺100 µm）。J：TUNEL阳性细胞百分比的定量柱状图（n=3，***p < 0.001）。K–O：Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3以及细胞质/线粒体细胞色素c（Cyto-c）的蛋白表达水平，并进行灰度定量分析（n=3，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001）。

DNJ通过直接靶向ATP5F1影响线粒体能量代谢、ROS稳态和凋亡通路

在高糖环境下，线粒体功能障碍可诱导ROS过度生成和氧化应激损伤。本研究中，高糖处理导致ROS和MDA水平升高，SOD活性和GSH含量下降；DNJ干预可逆转上述变化。敲低ATP5F1会削弱DNJ的抗氧化作用，而ATP5F1过表达可缓解氧化应激损伤。线粒体功能障碍和氧化应激过度激活通常会导致细胞凋亡。本研究发现，高糖处理可导致Bax/Bcl-2比值升高、Cleaved caspase-3表达上调、Cyto-c从线粒体释放至细胞质，并显著增加细胞凋亡率。DNJ可有效逆转上述变化；当ATP5F1被敲低时，DNJ的抗凋亡作用明显减弱；而ATP5F1过表达可模拟DNJ的部分作用，恢复Bax/Bcl-2平衡，降低Cleaved caspase-3表达，抑制Cyto-c释放，并减少凋亡。

总体而言，研究数据表明，DNJ可靶向ATP5F1，并由此影响下游线粒体能量代谢、ROS稳态和凋亡信号通路。这项研究不仅鉴定出DNJ治疗DCM的一个新分子机制，也为通过靶向ATP5F1开发代谢性心肌病新治疗策略奠定了基础。不过，作者也指出本研究仍有局限：其一，本研究主要在H9c2细胞系中完成，尽管模型较为可靠，但仍需在原代心肌细胞中验证；其二，分子对接预测的结合位点仍需通过定点突变实验确认；其三，本研究主要依赖体外实验，未来需建立糖尿病心肌病动物模型，例如链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）诱导糖尿病小鼠，系统评价DNJ的体内疗效及其对心功能的影响，并利用ATP5F1心肌细胞特异性敲除小鼠确认其靶点依赖性作用。

图7：DNJ通过直接靶向ATP5F1发挥心肌保护作用的机制模型。在高糖应激下，心肌细胞发生损伤，其特征为线粒体功能障碍，导致膜电位丧失、ATP生成减少，并引发继发性氧化应激。这种氧化还原失衡进一步触发线粒体凋亡通路。本研究鉴定ATP5F1这一ATP合酶核心亚基为DNJ的直接功能靶点。DNJ与ATP5F1结合可缓解整个病理级联反应：保护线粒体完整性、减少ROS生成，并抑制凋亡激活。小干扰和过表达实验共同证明，ATP5F1是DNJ对抗糖尿病心肌病保护作用的中心介导因子。

【贡献】★★★★★

本研究证实，DNJ可明显减轻高糖诱导的心肌细胞损伤，具体表现为线粒体功能障碍、氧化应激和细胞凋亡得到改善。通过靶向ATP5F1，DNJ可调控下游线粒体能量代谢和细胞存活信号级联反应，从而发挥多方面的心肌保护作用。这一发现不仅为阐明DNJ治疗DCM的分子机制提供了直接依据，也为开发以ATP5F1为特异性靶点的代谢性心肌病新治疗策略奠定了重要基础。

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