Autophagy (IF=18.6)｜高脂饮食如何加重结肠炎？STAT3双重抑制TFEB，导致溶酶体失能与肠屏障破坏！(张吉翔/董卫国—武汉大学人民医院)

2026年5月21日，武汉大学人民医院消化内科张吉翔、董卫国团队，联合武汉大学药学院、南华大学附属第一医院、浙江大学医学院附属第一医院等单位，在Autophagy（中科院1区，IF=18.6）在线发布题为“High-fat Diet Exacerbates Experimental Colitis by Inhibiting Lysosomal Function via the STAT3-TFEB Axis”的研究论文接受稿。该刊2025年中科院分区为生物学大类1区，最新公布的Impact Factor为18.6。

炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）发病率的上升与饮食西方化密切相关，高脂饮食被认为是其中一个重要风险因素。然而，高脂摄入究竟如何作用于肠上皮细胞，并在炎症状态下加重肠黏膜损伤，仍缺乏完整的分子机制解释。

本研究采用高脂饮食联合葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）诱导的小鼠结肠炎模型，以及棕榈酸（palmitic acid，PA）联合脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激的NCM460结肠上皮细胞模型，重点考察溶酶体和自噬-溶酶体通路（autophagy-lysosome pathway，ALP）在高脂饮食加重结肠炎过程中的作用。

研究发现，高脂饮食并非单纯增加炎症，而是使肠上皮细胞进入一种“修复缺陷”状态。在代谢与炎症应激共同作用下，信号转导与转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）Y705位点持续磷酸化，并通过两条途径共同抑制转录因子EB（transcription factor EB，TFEB）。

一方面，活化的STAT3直接结合TFEB启动子，抑制TFEB转录；另一方面，STAT3促进RRAG GTP酶依赖的MTOR向溶酶体表面募集，激活MTORC1并促进TFEB S211位点磷酸化，使TFEB滞留于细胞质中。TFEB受到双重抑制后，溶酶体膜通透性增加、酸化能力丧失、降解功能受损，自噬通量最终被阻断。

药理学激活TFEB或在肠上皮细胞中特异性敲除Stat3，均可恢复溶酶体功能和自噬通量，修复黏液屏障及细胞连接，并减轻小鼠实验性结肠炎。相反，再次敲低TFEB会削弱Stat3敲除带来的保护作用，从而进一步确认STAT3-TFEB轴是高脂饮食加重实验性结肠炎的关键机制。

需要强调的是，该研究结论来自细胞和小鼠模型。TFEB激活剂及STAT3相关干预目前不能直接表述为已经能够治疗人类IBD，其临床有效性和安全性仍需进一步验证。

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【摘 要】

高脂饮食（high-fat diet，HFD）摄入与炎症性肠病风险升高有关，但其潜在分子机制尚不明确。溶酶体和巨自噬/自噬-溶酶体通路对于维持肠上皮屏障具有重要作用。

本研究采用DSS诱导的小鼠结肠炎模型，以及LPS刺激的NCM460细胞模型。结果表明，动物体内的高脂饮食和细胞实验中的棕榈酸均可显著损害上皮屏障功能并加重炎症反应，这些变化与溶酶体功能及自噬-溶酶体通路受到抑制有关。

机制研究显示，在DSS或LPS相关炎症应激下，高脂饮食和棕榈酸分别促进STAT3 Y705位点磷酸化，即p-STAT3(Y705)升高，并通过两种机制共同抑制TFEB。

一方面，活化的STAT3直接结合TFEB启动子，抑制其转录；另一方面，STAT3促进MTOR向溶酶体募集并激活MTORC1，继而促进TFEB S211位点磷酸化，即p-TFEB(S211)升高，阻碍TFEB进入细胞核。

上述级联反应导致溶酶体膜通透性增加（lysosomal membrane permeabilization，LMP）、溶酶体酸化能力下降及降解功能受损。

肠上皮细胞特异性敲除Stat3或通过药物激活TFEB，均可恢复溶酶体功能、修复上皮屏障并减轻小鼠结肠炎。相反，经直肠给予AAV9-shTfeb敲低结肠上皮TFEB后，Stat3敲除产生的保护作用受到逆转。

本研究表明，动物体内的高脂饮食和细胞实验中的棕榈酸可通过STAT3-TFEB轴破坏溶酶体功能及肠上皮屏障，为研究饮食相关IBD的干预机制提供了新的方向。

01

研究背景及科学问题

炎症性肠病是一类慢性肠道炎症性疾病的统称，主要包括溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）和克罗恩病（Crohn disease，CD）。目前，IBD已成为影响全球数百万人群的重要健康负担，且发病率仍在持续上升。

20世纪，IBD主要流行于西方国家；进入21世纪后，非洲、拉丁美洲和亚洲等新近工业化地区的IBD发病率也在快速上升。这一流行病学变化与饮食及生活方式西方化同步发生，尤其与膳食脂肪摄入增加有关。

已有荟萃分析提示，高脂摄入与IBD发病易感性升高相关。然而，膳食脂肪酸如何作用于肠上皮细胞并调控肠道炎症，目前仍未得到充分阐明。

巨自噬/自噬是进化上高度保守的细胞质量控制系统，可将受损细胞器、蛋白质聚集体和细胞内病原体输送至溶酶体进行降解和循环利用。

在结肠上皮细胞中，自噬可抑制细胞凋亡、维持紧密连接（tight junction，TJ）结构、调节杯状细胞黏液分泌，并减轻炎症和氧化应激。相反，自噬受到抑制会加重肠道炎症。

在自噬降解的末端阶段，自噬体与富含水解酶的酸性溶酶体融合，形成自噬溶酶体，并分解其包裹的底物。因此，溶酶体是细胞应激反应和稳态维持的关键细胞器，溶酶体及ALP正常运行对于保护肠上皮屏障和控制炎症至关重要。

既往研究已经在胰腺、海马、肾脏和肝脏等多种组织中观察到高脂饮食抑制自噬通量的现象。基于此，研究团队提出，高脂饮食可能通过损害肠上皮细胞溶酶体功能、抑制ALP而加重结肠炎。

TFEB是溶酶体和ALP的核心转录调控因子。进入细胞核后，TFEB可启动“溶酶体协同表达与调控”（coordinated lysosomal expression and regulation，CLEAR）基因网络，调节溶酶体生成、酸化以及自噬体与溶酶体融合等过程。

作为TFEB的上游调节因子，雷帕霉素机制靶蛋白复合物1（mechanistic target of rapamycin complex 1，MTORC1）可促进TFEB S211位点磷酸化，减少其核定位并抑制其转录功能。TFEB功能异常已被证实参与多种炎症和代谢性疾病。

STAT3是炎症信号的重要介质。在溃疡性结肠炎模型中，肠上皮细胞内STAT3活化明显增强。已有研究还提示，STAT3可通过转录和非转录机制负向调节溶酶体及ALP，高脂饮食诱导的代谢应激也能激活包括结肠在内的多种组织中的STAT3信号。

然而，在饮食诱导的肠道炎症背景下，STAT3与TFEB之间是否存在直接联系，仍有待阐明。

本研究发现，高脂饮食可提高肠上皮细胞中STAT3 Y705位点的磷酸化水平。磷酸化STAT3一方面在转录水平抑制TFEB表达，另一方面促进MTOR向溶酶体表面募集，激活MTORC1并促进TFEB S211位点磷酸化。

这两种作用共同抑制TFEB的转录活性，引起溶酶体及ALP功能障碍，进而加重实验性结肠炎。该研究建立了膳食脂质暴露、肠上皮自噬调控及肠道炎症之间的机制联系。

02

重要发现及亮点

高脂饮食损伤肠上皮屏障并加重实验性结肠炎

研究团队首先将野生型小鼠分别给予普通饲料或高脂饮食8周，随后连续5天饮用2.5% DSS，以建立实验性结肠炎模型。

血脂检测显示，与普通饲料组相比，高脂饮食小鼠的总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇和游离脂肪酸水平均显著升高，证实小鼠出现高脂血症和代谢应激，但两组甘油三酯水平没有显著差异。

DSS处理后，与普通饲料小鼠相比，高脂饮食小鼠体重下降更快、疾病活动指数（disease activity index，DAI）更高，结肠缩短也更加明显。

组织学结果显示，高脂饮食加重了DSS诱导的炎症细胞浸润、隐窝丢失和黏膜损伤，并提高结肠组织学评分。阿利新蓝-过碘酸希夫（Alcian blue-periodic acid-Schiff，AB-PAS）染色显示，杯状细胞数量及黏液分泌减少，黏蛋白MUC2表达下调，提示结肠黏液屏障受到破坏。

Western blot和免疫荧光检测显示，DSS降低了紧密连接蛋白TJP1和OCLN以及黏附连接蛋白CDH1的表达，而高脂饮食进一步加重了这些变化。透射电子显微镜观察也显示，高脂饮食与DSS联用造成更严重的微绒毛损伤和紧密连接结构破坏。

TUNEL染色显示，高脂饮食联合DSS显著增加结肠上皮细胞凋亡。与此同时，促凋亡蛋白BAX升高，抗凋亡蛋白BCL2下降。

为确定脂质能否直接损伤肠上皮细胞，研究进一步采用200 μM棕榈酸处理NCM460细胞。该剂量本身不会引起明显细胞毒性，但可产生代谢应激。

与单独LPS刺激相比，棕榈酸与LPS联合处理进一步降低TJP1、OCLN、CDH1和BCL2表达，提高BAX水平，并增加细胞凋亡比例，说明棕榈酸可在炎症应激背景下直接增强肠上皮损伤。

单独给予高脂饮食尚未引起明显的临床或病理性结肠炎，但小鼠结肠上皮TUNEL阳性细胞和BAX水平轻度升高，OCLN和CDH1有所下降。这提示高脂饮食本身可能已经降低肠上皮屏障的抗损伤能力。

研究还建立了无需提前适应8周、由高脂饮食与DSS同步开始的短期模型。结果同样显示，短期高脂暴露足以加重体重下降、DAI升高、脾脏指数增加及结肠缩短，并造成黏膜、黏液屏障和细胞连接损伤。

这些结果表明，高脂饮食加重结肠炎并不完全依赖长期全身性代谢紊乱，肠腔内膳食脂质对肠上皮的直接脂毒性同样发挥重要作用。

图1：高脂饮食在体内和体外损伤肠上皮屏障，并加重实验性结肠炎。（A）实验设计示意图。野生型小鼠（n=6）接受普通饲料（NCD）或高脂饮食（HFD）8周，随后连续5天饮用普通饮水或2.5%（w:v）DSS。（B）DSS处理5天期间小鼠体重变化。（C）DAI评分变化。（D）各处理组小鼠结肠的代表性图像。（E）结肠长度定量分析。（F）脾脏重量指数，计算方式为脾脏重量（mg）:体重（g）。（G）小鼠结肠组织学评分。（H）H&E染色、MUC2免疫组织化学（IHC）染色及AB-PAS染色的代表性图像。比例尺：H&E上排图像为500 μm，H&E下排图像为100 μm，MUC2及AB-PAS图像为100 μm。（I）小鼠结肠组织中TJP1和OCLN的代表性免疫荧光图像。（J）小鼠结肠组织TUNEL染色的代表性图像；荧光强度和TUNEL阳性细胞定量见补充图S1N和S1Q。比例尺=50 μm。（K）NCM460细胞中TJP1的代表性免疫荧光图像，定量结果见补充图S1O。（L）NCM460细胞按照图示分组处理后的Western blot结果，定量结果见补充图S1P。（M）小鼠结肠组织的代表性透射电子显微镜图像，比例尺：上排为500 nm，下排为200 nm。（N）小鼠结肠组织Western blot结果，定量结果见补充图S1R。（O）采用流式细胞术分析不同处理组NCM460细胞的凋亡情况。（P）相应定量结果，n=3。ns表示P>0.05；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

高脂饮食加重溶酶体损伤并阻断自噬-溶酶体通路

研究对LPS组与棕榈酸联合LPS组NCM460细胞进行转录组测序。KEGG富集分析显示，自噬和溶酶体通路发生显著变化。

对普通饲料+DSS组和高脂饮食+DSS组小鼠结肠组织进行转录组分析后，也观察到溶酶体、内吞、紧密连接及黏附连接相关通路显著富集。这些结果提示，高脂饮食可能通过破坏结肠溶酶体功能和自噬降解过程加重结肠炎。

SQSTM1/p62是自噬受体和自噬降解底物，其积聚通常提示自噬受到抑制。LC3-II与自噬体膜结合，可反映自噬体形成情况。

研究使用氯喹（chloroquine，CQ）抑制溶酶体降解，以评价自噬通量。与单独LPS处理相比，加入棕榈酸显著阻碍自噬通量。即使不加入氯喹，棕榈酸联合LPS组也出现LC3-II和SQSTM1大量积聚，提示棕榈酸主要抑制自噬降解末端，而不是阻止自噬体形成。

mRFP-eGFP-LC3双荧光报告系统显示，自噬体在中性环境中同时呈现红色和绿色荧光，叠加后表现为黄色斑点；当自噬体与酸性溶酶体融合后，eGFP绿色信号被淬灭，形成仅呈红色的自噬溶酶体。

LPS或棕榈酸单独处理均可增加黄色斑点，两者联合处理后的黄色信号积聚更加明显，提示溶酶体酸化及自噬体-溶酶体融合受到损害。

Western blot结果显示，棕榈酸和LPS均降低溶酶体标志蛋白LAMP1、LAMP2及组织蛋白酶CTSB和CTSD成熟形式的表达，同时使SQSTM1和LC3-II积聚。联合处理产生的变化最为明显。小鼠结肠组织中也观察到相似结果。

透射电子显微镜显示，棕榈酸处理后细胞内溶酶体数量减少。研究据此进一步分析溶酶体膜通透性、酸性环境及降解能力。

吖啶橙染色显示，棕榈酸处理后代表酸性溶酶体的红色荧光明显减弱。LysoSensor Yellow/Blue探针检测显示，棕榈酸联合LPS组溶酶体腔内pH升高；LysoSensor Green流式细胞术检测也显示荧光强度降低，证实溶酶体酸化能力受损。

正常情况下弥散分布于细胞质中的半乳糖凝集素3（LGALS3/Gal3），在溶酶体膜受损后会形成特征性荧光斑点。棕榈酸处理的细胞以及高脂饮食+DSS小鼠结肠组织均出现LGALS3斑点，表明发生溶酶体膜通透性增加。

在预先装载70 kDa FITC-葡聚糖的细胞中，棕榈酸处理后绿色信号从溶酶体逸出并弥散至细胞质，进一步证实溶酶体膜受到破坏。

功能实验显示，棕榈酸显著降低溶酶体对DQ-BSA-Green蛋白底物的水解能力，并阻碍BODIPY标记脂质的降解。透射电子显微镜还显示，高脂饮食+DSS小鼠结肠上皮细胞内出现脂滴积聚。

综上，高脂饮食和棕榈酸可减少溶酶体数量、增加溶酶体膜通透性，破坏溶酶体酸性稳态并降低其降解功能，最终阻断自噬通量。

图2：高脂饮食加重结肠炎中的溶酶体损伤和自噬-溶酶体通路功能障碍。（A）对LPS或PA+LPS处理的NCM460细胞进行转录组测序，并开展KEGG富集分析，n=3。（B）采用CQ检测自噬通量。（C）相应定量分析，n=3。（D）小鼠结肠组织的代表性透射电子显微镜图像；Ly表示溶酶体，AP表示自噬体；比例尺：上排500 nm，下排200 nm。（E）各图示处理组采用LysoSensor Green探针进行流式细胞术分析。（F）荧光强度统计分析，n=3。（G）各图示处理组的mRFP-eGFP-LC3报告实验；红色:黄色LC3荧光强度比值的定量结果见补充图S2G。（H）小鼠结肠组织中LGALS3和LAMP1的代表性免疫荧光图像，比例尺=20 μm，定量结果见补充图S2E。（I）NCM460细胞中LGALS3和LAMP1的代表性免疫荧光图像，比例尺=10 μm，定量结果见补充图S2I。（J）NCM460细胞Western blot结果。（K）表达mCherry-LAMP1并预先装载FITC-葡聚糖的NCM460细胞代表性荧光图像，比例尺=10 μm，荧光定量见补充图S2H。（L）吖啶橙染色代表性图像，比例尺=10 μm，定量结果见补充图S2J。（M）DQ Green BSA染色代表性图像，比例尺=10 μm，定量结果见补充图S2L。（N）BODIPY染色代表性图像，比例尺=10 μm，定量结果见补充图S2M。ns表示P>0.05；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

激活TFEB可恢复溶酶体功能并减轻结肠炎

TFEB是ALP的核心调控因子。当细胞感受到溶酶体功能障碍时，TFEB通常进入细胞核并激活CLEAR基因网络，促进溶酶体生成和自噬相关基因表达，以恢复细胞降解能力。

研究发现，高脂饮食和棕榈酸不仅造成溶酶体损伤，还同时抑制了这一代偿性修复机制。NCM460细胞和小鼠结肠组织的Western blot结果显示，高脂饮食或棕榈酸降低TFEB总表达，提高p-TFEB(S211)水平，并减少TFEB核转位。PA+LPS处理后，多个TFEB靶基因的转录水平也随之下降。

为验证TFEB激活能否修复受损溶酶体，研究采用TFEB激活剂1（TFEB activator 1，TA1，又称Curcumin C1）进行干预。

TA1可显著促进TFEB进入细胞核，并提高溶酶体及ALP相关基因的转录水平。mRFP-eGFP-LC3实验显示，TA1减少PA+LPS引起的黄色自噬体积聚，同时增加仅呈红色的自噬溶酶体，说明自噬通量得到恢复。CQ辅助实验得到了相同结果。

TA1还恢复了吖啶橙红色荧光和LysoSensor Green荧光强度，并降低溶酶体腔内pH，说明溶酶体重新获得酸化能力。

同时，TA1减少LGALS3斑点和FITC-葡聚糖泄漏，恢复溶酶体膜完整性，并提高溶酶体对DQ-BSA-Green及BODIPY标记脂质的降解能力。LAMP1、LAMP2及成熟CTSB和CTSD的表达也得到恢复。过表达TFEB产生了相似作用。

在NCM460细胞中，TA1上调TJP1、OCLN和CDH1，抑制细胞凋亡，说明修复ALP有助于恢复肠上皮屏障。

在高脂饮食+DSS小鼠中，口服TA1增加结肠上皮溶酶体数量，恢复LAMP1、成熟CTSB和CTSD表达，并减少LGALS3斑点。

TA1还减轻小鼠体重下降，降低DAI和脾脏指数，改善结肠缩短、炎症和组织损伤，恢复黏液屏障、紧密连接及微绒毛结构，并减少TUNEL阳性上皮细胞。

这些结果表明，药理学激活TFEB可重建溶酶体功能、恢复自噬通量并修复肠上皮屏障，从而减轻高脂饮食加重的实验性结肠炎。

图3：高脂饮食通过抑制TFEB，降低溶酶体功能和自噬-溶酶体通路活性，从而加重实验性结肠炎。（A）NCM460细胞Western blot分析，定量结果见补充图S3A。（B）NCM460细胞接受5 μM TA1处理24 h后，对细胞核和细胞质蛋白组分进行Western blot分析，定量结果见补充图S3E。（C）TA1处理后，使用CQ检测NCM460细胞自噬通量。（D）相应统计分析，n=3。（E）吖啶橙染色代表性图像，定量结果见补充图S3O。（F）DQ Green BSA染色代表性图像，定量结果见补充图S3P。（G）采用RT-PCR检测TA1处理后NCM460细胞中溶酶体和ALP相关基因。（H）细胞中LGALS3和LAMP1的代表性免疫荧光图像，定量结果见补充图S3M。（I）NCM460细胞Western blot分析，定量结果见补充图S3T。（J）mRFP-eGFP-LC3报告实验，定量结果见补充图S3S。（K）H&E染色、MUC2免疫组织化学染色及AB-PAS染色代表性图像。（L）小鼠结肠组织中TJP1和OCLN的代表性免疫荧光图像，定量结果见补充图S4J。（M、N）小鼠结肠组织的代表性透射电子显微镜图像；N中Ly表示溶酶体，AP表示自噬体。（O）小鼠结肠组织TUNEL染色代表性图像，定量结果见补充图S4K。本图中相同实验的比例尺与前述图中的对应实验一致。ns表示P>0.05；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

STAT3在转录和翻译后两个层面共同抑制TFEB

研究通过整合KnockTF、ChIP-Atlas、ENCODE和GTRD四个数据库中的TF-Target数据，并结合GTEx和TCGA相关性分析，预测TFEB的上游转录因子，最终筛选出包括STAT3在内的3个候选分子。

Western blot和免疫荧光结果显示，在炎症条件下，动物体内的高脂饮食和细胞实验中的棕榈酸均促进p-STAT3(Y705)表达及其核转位。

研究随后利用JASPAR数据库预测TFEB启动子中的STAT3结合位点，并选择两个评分超过10、相关性超过90%的位点进行验证。

在NCM460细胞中过表达带HA标签的STAT3后，ChIP-qPCR证实HA-STAT3富集于预测位点，其中P1被确定为TFEB启动子上的STAT3结合位点。使用p-STAT3(Y705)抑制剂Stattic后，HA-STAT3在P1位点的富集明显下降。

在稳定敲低STAT3的NCM460细胞中，TFEB的mRNA和蛋白表达均明显升高。这说明p-STAT3(Y705)能够直接结合TFEB启动子，并抑制TFEB转录。

值得注意的是，STAT3敲低不仅提高TFEB总表达，还降低了p-TFEB(S211)水平，提示STAT3同时参与TFEB的翻译后调控。

研究发现，棕榈酸可增强MTOR及其下游底物RPS6和EIF4EBP1的磷酸化，提示MTORC1被激活。敲低STAT3后，上述磷酸化变化显著减弱。

PA+LPS同时增强了PPP3/钙调神经磷酸酶活性，但这一结果与“STAT3通过抑制PPP3促进TFEB磷酸化”的假设不符。因此，研究排除了PPP3活性下降作为主要机制的可能性。

使用MTOR激酶抑制剂Torin1后，MTOR、RPS6和EIF4EBP1磷酸化受到抑制，棕榈酸诱导的p-TFEB(S211)升高也被逆转，说明STAT3主要通过激活MTORC1促进TFEB磷酸化。

核质分离和免疫荧光实验进一步显示，棕榈酸减少细胞核内TFEB，而STAT3敲低可恢复TFEB核转位，并提高多个TFEB靶基因的转录水平。

溶酶体分离和免疫荧光共定位分析显示，PA+LPS促进MTOR及p-MTOR(S2448)向溶酶体募集；敲低STAT3后，这种溶酶体富集明显消失。

上述结果表明，STAT3一方面直接抑制TFEB转录，另一方面促进MTOR向溶酶体表面募集、激活MTORC1，并增加TFEB S211位点磷酸化，从而在两个层面共同抑制TFEB。

图4：高脂饮食激活STAT3，抑制TFEB转录，并通过RRAG GTP酶激活MTORC1，从而双重抑制TFEB功能。（A）使用基于R语言的网络应用预测TFEB转录因子。（B）NCM460细胞Western blot分析，定量结果见补充图S5A。（C）NCM460细胞细胞质和细胞核组分Western blot分析，定量结果见补充图S5O。（D）NCM460细胞中STAT3和p-STAT3(Y705)免疫荧光检测，比例尺=10 μm，定量结果见补充图S5D。（E）STAT3结合基序。（F）使用JASPAR数据库预测TFEB启动子区域中的STAT3结合位点。（G）小鼠结肠组织p-STAT3(Y705)免疫荧光检测，比例尺=50 μm，定量结果见补充图S5E。（H、I）采用ChIP-qPCR验证预测结合位点。（J、L—O）NCM460细胞Western blot分析，定量结果见补充图S5F、S5G及S5P—S5R。（K）采用RT-PCR检测NCM460细胞中TFEB表达，n=3。（P）转染shNC或shSTAT3的NCM460细胞中，LAMP1绿色信号与总MTOR红色信号共定位的代表性免疫荧光图像。（Q）LAMP1绿色信号与p-MTOR(S2448)红色信号共定位的代表性图像，比例尺=10 μm。（R）对P中MTOR与溶酶体的共定位系数进行定量。（S）对Q中p-MTOR(S2448)与溶酶体的共定位系数进行定量；来自3次独立实验的不少于50个细胞。（T）分离细胞质和溶酶体组分后，对MTOR和LAMP1进行Western blot分析及相应定量，n=4。柱状图数据以均值±标准误表示，细胞定量数据以箱线图表示。ns表示P>0.05；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

RRAG GTP酶介导STAT3诱导的MTORC1激活和溶酶体损伤

MTORC1的激活依赖RRAG GTP酶将其募集至溶酶体表面。为确定RRAG是否介导STAT3与MTORC1之间的联系，研究采用siRNA同时敲低RRAGC和RRAGD。

在PA+LPS处理的细胞中，敲低RRAGC和RRAGD可模拟STAT3缺失产生的效应，包括抑制MTORC1激活、降低p-TFEB(S211)，并提高ALP相关蛋白表达。

RRAGC和RRAGD敲低还可恢复溶酶体酸化和降解能力，减少LGALS3斑点形成，缓解溶酶体膜通透性增加。

研究随后在STAT3敲低细胞中共同表达带FLAG标签的持续活化型RRAG突变体，包括RRAGAQ66L、RRAGCS75N和RRAGDS77L。

即使STAT3已经敲低，持续活化RRAG仍可重新激活MTORC1、提高TFEB S211位点磷酸化，并再次引起溶酶体酸化和降解功能障碍。

这些结果表明，p-STAT3(Y705)通过促进RRAG GTP酶依赖的MTOR溶酶体募集，激活MTORC1并抑制TFEB。Torin1对MTORC1的抑制还可减轻棕榈酸加重的肠上皮屏障损伤，进一步支持这一通路的功能意义。

图5：活化STAT3通过促进RRAG GTP酶介导的MTORC1激活，增强TFEB磷酸化并导致溶酶体功能障碍。（A）在PA+LPS处理条件下，转染siNC或siRRAGC+siRRAGD的NCM460细胞中MTORC1信号及TFEB磷酸化的Western blot分析，定量结果见补充图S6D。（B）转染siNC或siRRAGC+siRRAGD细胞中ALP相关蛋白的Western blot分析，定量结果见补充图S6E。（C）Western blot显示，持续活化型RRAG突变体RRAG-CA，包括RRAGAQ66L、RRAGCS75N和RRAGDS77L，可逆转STAT3敲低对MTORC1信号和TFEB磷酸化的影响，定量结果见补充图S6F。（D）重新表达RRAG-CA的STAT3敲低细胞中ALP相关蛋白Western blot分析，定量结果见补充图S6G。（E）转染siNC或siRRAGC+siRRAGD细胞中LysoSensor Green荧光强度的流式细胞术分析，n=3。（F）重新表达RRAG-CA的STAT3敲低细胞中LysoSensor Green荧光强度的流式细胞术分析，n=3。（G）Western blot验证带FLAG标签的RRAG-CA表达并进行相应定量，n=3。（H）转染siNC或siRRAGC+siRRAGD细胞中LGALS3和LAMP1的代表性免疫荧光图像，比例尺=10 μm。（I）对H中每个细胞的LGALS3斑点数量进行定量；来自3次独立实验的不少于30个细胞。（J）重新表达RRAG-CA的STAT3敲低细胞中LGALS3和LAMP1的代表性免疫荧光图像，比例尺=10 μm。（K）对J中每个细胞的LGALS3斑点数量进行定量；来自3次独立实验的不少于30个细胞。（L）转染siNC或siRRAGC+siRRAGD细胞的DQ-BSA-Green染色代表性图像，比例尺=10 μm。（M）对L中DQ-BSA-Green平均荧光强度进行定量；来自3次独立实验的不少于30个细胞。（N）重新表达RRAG-CA的STAT3敲低细胞中DQ-BSA-Green染色代表性图像，比例尺=10 μm。（O）对N中DQ-BSA-Green平均荧光强度进行定量；来自3次独立实验的不少于30个细胞。柱状图数据以均值±标准误表示，细胞定量数据以箱线图表示；Western blot灰度定量见补充图S6。ns表示P>0.05；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

敲低或敲除STAT3可恢复溶酶体功能和自噬通量

为验证STAT3是否是高脂饮食诱导溶酶体损伤的核心上游信号，研究构建了肠上皮细胞特异性Stat3敲除小鼠stat3ΔIEC，并在普通饲料或高脂饮食条件下给予DSS。

在细胞实验中，CQ辅助检测显示，敲低STAT3可恢复棕榈酸应激下的自噬通量，并减少LC3-II和SQSTM1异常积聚。mRFP-eGFP-LC3报告系统也显示，STAT3敲低可抑制大量黄色自噬体的异常积聚。

在stat3ΔIEC小鼠中，高脂饮食+DSS引起的SQSTM1和LC3-II积聚同样明显减轻，提示肠上皮自噬通量得到恢复。

STAT3敲低还减少细胞内LGALS3斑点及FITC-葡聚糖向细胞质泄漏。stat3ΔIEC小鼠结肠组织中也观察到类似变化，说明STAT3是诱导溶酶体膜通透性增加的重要因素。

LysoSensor Green、LysoSensor Yellow/Blue及吖啶橙检测一致显示，敲低STAT3可防止PA+LPS造成的溶酶体去酸化，使溶酶体维持较低的腔内pH。

透射电子显微镜显示，即使接受高脂饮食和DSS刺激，stat3ΔIEC小鼠结肠上皮细胞仍能维持足够数量的溶酶体，脂滴积聚也明显减少。

STAT3缺失还恢复了LAMP1以及成熟CTSB和CTSD的表达，并提高溶酶体对DQ-BSA-Green蛋白底物及BODIPY标记脂质的降解能力。

这些结果表明，高脂饮食激活的STAT3是溶酶体损伤的重要驱动因素。STAT3通过破坏溶酶体膜完整性，引起酸性环境崩溃和降解能力丧失，最终阻断自噬通量。

图6：高脂饮食通过激活STAT3损害溶酶体功能和自噬-溶酶体通路。（A）使用LysoSensor Green探针检测溶酶体pH。（B）荧光强度定量分析，n=3。（C）使用LysoSensor Yellow/Blue探针对溶酶体pH进行定量。（D）采用CQ辅助检测NCM460细胞自噬通量。（E）相应定量分析，n=3。（F）实验示意图：Stat3fl/fl与stat3ΔIEC小鼠（n=6）均被随机分为两组，分别接受NCD+DSS或HFD+DSS处理。（G）小鼠结肠组织的代表性透射电子显微镜图像；Ly表示溶酶体，AP表示自噬体。（H）mRFP-eGFP-LC3报告实验，定量结果见补充图S7D。（I）NCM460细胞Western blot分析，定量结果见补充图S7K。（J）表达mCherry-LAMP1并预先装载FITC-葡聚糖的NCM460细胞代表性荧光图像，定量结果见补充图S7F。（K）NCM460细胞中LGALS3和LAMP1的代表性免疫荧光图像，定量结果见补充图S7E。（L）小鼠结肠组织中LGALS3和LAMP1的代表性免疫荧光图像，定量结果见补充图S7J。（M）吖啶橙染色代表性图像，定量结果见补充图S7G。（N）DQ Green BSA染色代表性图像，定量结果见补充图S7H。（O）BODIPY染色代表性图像，定量结果见补充图S7I。本图中相同实验的比例尺与前述图中的对应实验一致。数据以均值±标准误表示。ns表示P>0.05；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

肠上皮细胞特异性敲除Stat3可减轻高脂饮食加重的结肠炎

与Stat3fl/fl对照小鼠相比，肠上皮细胞特异性敲除Stat3可显著减轻普通饲料和高脂饮食条件下的DSS结肠炎，并明显削弱高脂饮食的加重作用。

高脂饮食条件下，stat3ΔIEC小鼠体重下降较少，DAI和脾脏指数降低，结肠缩短得到改善。H&E染色显示，其炎症细胞浸润、隐窝破坏和黏膜损伤明显减少，组织学评分降低。

AB-PAS和MUC2免疫组织化学结果显示，即使接受高脂饮食，stat3ΔIEC小鼠仍可较好地维持杯状细胞数量和黏液分泌。

Western blot及免疫荧光显示，stat3ΔIEC小鼠结肠组织中的TJP1、OCLN和CDH1表达得到维持。透射电子显微镜还显示，紧密连接和微绒毛结构明显恢复。

TUNEL染色显示，stat3ΔIEC小鼠结肠上皮凋亡细胞减少，BAX和BCL2的异常变化也得到逆转。

在NCM460细胞中敲低STAT3同样恢复TJP1、OCLN、CDH1和BCL2表达，降低BAX及细胞凋亡比例。

这些结果表明，高脂饮食诱导的STAT3激活是加重肠上皮屏障损伤和实验性结肠炎的重要原因。

图7：高脂饮食通过激活STAT3加重实验性结肠炎。（A）结肠炎小鼠体重变化。（B）DAI评分变化。（C）小鼠结肠形态和长度的代表性图像。（D）结肠长度统计分析。（E）小鼠结肠组织H&E染色、MUC2免疫组织化学染色和AB-PAS染色代表性图像。（F）小鼠结肠组织TJP1和OCLN免疫荧光图像，定量结果见补充图S8A。（G）小鼠结肠组织TUNEL染色。（N）相应定量分析，n=6。（H）NCM460细胞TJP1的代表性免疫荧光图像，定量结果见补充图S8B。（I）NCM460细胞Western blot分析，定量结果见补充图S8E。（J）小鼠结肠组织的代表性透射电子显微镜图像。（K）小鼠结肠组织Western blot分析，定量结果见补充图S8F。（L）采用流式细胞术分析NCM460细胞凋亡。（M）相应统计结果，n=3。本图中相同实验的比例尺与前述图中的对应实验一致。数据以均值±标准误表示。ns表示P>0.05；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

TFEB是STAT3介导肠上皮损伤的关键下游效应分子

前述结果表明，STAT3敲低或敲除能够恢复溶酶体功能、ALP及肠上皮屏障。研究进一步考察TFEB是否是STAT3产生上述作用所必需的下游分子。

在已稳定敲低STAT3、对PA+LPS损伤具有抵抗性的NCM460细胞中，研究进一步采用siRNA敲低TFEB。

TFEB敲低后，溶酶体及ALP相关蛋白再次下降，TJP1等屏障相关蛋白受到破坏，细胞凋亡重新增加。这表明，STAT3敲低带来的保护作用依赖TFEB。

动物实验中，研究通过直肠给予携带Tfeb靶向shRNA的腺相关病毒AAV9-shTfeb，在stat3ΔIEC小鼠结肠上皮中特异性降低TFEB。

在高脂饮食+DSS条件下，AAV9-shTfeb明显逆转了Stat3敲除的保护作用。小鼠溶酶体及ALP相关蛋白再次下降，并重新出现明显体重下降、DAI升高和结肠缩短。

组织学和分子检测进一步显示，AAV9-shTfeb导致结肠病理损伤加重、黏液减少、TJP1和OCLN等紧密连接蛋白下降、紧密连接超微结构破坏及大范围上皮细胞凋亡。

由此，研究确认，高脂饮食通过肠上皮细胞STAT3-TFEB信号轴破坏ALP，并加重实验性结肠炎。

图8：高脂饮食通过STAT3-TFEB轴加重实验性结肠炎。（A、C）稳定敲低STAT3的NCM460细胞Western blot分析，定量结果见补充图S9A和S9B。（B）STAT3敲低NCM460细胞中TJP1的代表性免疫荧光图像，定量结果见补充图S9F。（D）采用流式细胞术分析细胞凋亡。（E）相应统计分析，n=3。（F）实验示意图：接受NCD+DSS或HFD+DSS处理的stat3ΔIEC小鼠，每组n=6，经直肠给予AAV9-shTfeb或AAV9-shNC。（G）小鼠DAI评分变化。（H）体重变化。（I、J）stat3ΔIEC小鼠结肠组织Western blot分析，定量结果见补充图S9I和S9J。（K）小鼠组织H&E染色、MUC2免疫组织化学染色和AB-PAS染色代表性图像。（L）小鼠结肠组织TJP1和OCLN的代表性免疫荧光图像，定量结果见补充图S9H。（M）小鼠结肠组织的代表性透射电子显微镜图像。（N）小鼠结肠组织TUNEL染色代表性图像。本图中相同实验的比例尺与前述图中的对应实验一致，定量结果见补充图S9G。数据以均值±标准误表示。ns表示P>0.05；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

机制示意图总结

在普通饮食或基础状态下，肠上皮细胞内活化STAT3维持在较低水平。TFEB能够顺利进入细胞核，启动CLEAR网络转录，从而维持溶酶体生成、酸化、降解、自噬通量及肠上皮屏障完整性，使上皮细胞能够抵御炎症刺激。

在高脂饮食和炎症共同存在时，膳食脂肪酸与DSS促进STAT3 Y705位点磷酸化。

p-STAT3(Y705)通过两种机制抑制TFEB。首先，p-STAT3进入细胞核并直接结合TFEB启动子，抑制TFEB基因表达；其次，p-STAT3促进RRAG GTP酶依赖的MTORC1溶酶体募集。

MTORC1在溶酶体表面过度活化后，促进TFEB S211位点抑制性磷酸化，使TFEB滞留于细胞质中。

这种双重抑制超过了细胞自身的溶酶体修复能力，导致溶酶体膜通透性增加、酸化能力丧失和自噬通量阻断。肠上皮细胞由适应性应激状态转变为“修复缺陷”状态，对炎症损伤更加敏感，最终加重结肠炎。

图9：高脂饮食加重结肠炎的作用机制示意图。左侧，普通饲料或基础状态下，肠上皮细胞维持较低水平的活化STAT3。因此，TFEB可有效进入细胞核，驱动CLEAR网络转录，维持良好的溶酶体功能、自噬通量和上皮屏障完整性，使细胞能够抵御炎症刺激。右侧，高脂饮食和炎症状态下，膳食脂肪酸与DSS诱导STAT3磷酸化，即p-STAT3(Y705)升高。活化STAT3通过两种途径抑制TFEB：其一为转录抑制，p-STAT3进入细胞核并直接结合TFEB启动子，抑制TFEB基因表达；其二为翻译后抑制，p-STAT3促进RRAG GTP酶依赖的MTORC1向溶酶体表面募集，导致MTORC1过度活化，并促进TFEB抑制性磷酸化，即p-TFEB(S211)升高，使其被限制在细胞质中。这种协同抑制超过细胞自身的修复能力，引起溶酶体膜通透性增加、酸化能力丧失及自噬通量阻断。最终，这种“修复缺陷”状态使肠上皮更容易受到炎症损伤，从而加重结肠炎。

【贡献】★★★★★

本研究表明，高脂饮食可在炎症应激背景下持续激活肠上皮细胞中的STAT3，并对TFEB产生双重抑制作用。

一方面，p-STAT3(Y705)直接结合TFEB启动子，抑制TFEB转录；另一方面，STAT3通过RRAG GTP酶促进MTORC1向溶酶体表面募集，增强TFEB S211位点磷酸化并阻止其核转位。

TFEB受到抑制后，细胞无法正常启动CLEAR网络及溶酶体修复程序，继而出现溶酶体数量减少、膜通透性增加、酸化能力下降和降解功能受损。自噬通量因此被阻断，肠上皮紧密连接、黏液屏障及细胞存活均受到影响，最终加重实验性结肠炎。

药理学激活TFEB或肠上皮细胞特异性敲除Stat3，均可恢复溶酶体和ALP功能，修复肠上皮屏障并减轻小鼠结肠炎。进一步敲低TFEB则可消除Stat3敲除的保护作用，证实TFEB是STAT3介导这一病理过程的关键下游效应分子。

研究还提示，高脂饮食或棕榈酸单独存在时，虽然能够引起一定程度的ALP功能障碍和屏障蛋白下降，但尚不足以造成大规模细胞凋亡和明显结肠炎。因此，高脂饮食更可能是一种降低肠上皮细胞抗损伤能力的易感因素，而不是单独引起结肠炎的充分条件。代谢应激与炎症应激在STAT3节点汇聚，最终使TFEB受到最大程度抑制。

本研究仍存在一定局限。STAT3-TFEB轴在人类IBD中的作用尚需通过具有不同膳食背景的患者结肠活检样本加以验证；棕榈酸最初通过何种膜受体或感受器触发STAT3磷酸化也尚未明确，TLR4、CD36等分子的参与需要进一步研究。此外，TFEB激活剂的特异性、长期安全性和临床转化价值仍需系统评价。

总体而言，该研究揭示了高脂饮食通过STAT3-TFEB轴破坏肠上皮溶酶体功能和自噬-溶酶体通路、进而加重实验性结肠炎的分子机制，为理解饮食、代谢应激和肠道炎症之间的相互作用提供了新的机制依据。

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