【Nat Com】祸乱之源！瑞士伯尔尼大学最新研究揭示下丘脑神经元集群内睡眠-觉醒神经表征的时间性漂移

撰文：Bane

下丘脑是参与维持多种生理功能的核心脑结构，涵盖摄食、生殖、战斗或逃跑反应及睡眠-觉醒状态等过程。下丘脑外侧区（LH）包含多种神经元群体，其特征在于不同的生物学和化学标志物，包括囊泡谷氨酸转运体2（Vglut2，谷氨酸能神经元标志物）、γ-氨基丁酸（GABA，Vgat）以及神经肽下丘脑泌素/食欲素（Hcrt/OX）和黑色素聚集激素（MCH）。抑制性LH-Vgat神经元与兴奋性LH-Vglut2神经元在觉醒及快速眼动睡眠期的放电率均高于非快速眼动睡眠期，且其激活可促进觉醒。

图片来源： Nature Neuroscience (2019)

类似地，共释放谷氨酸的LH-Hcrt/OX神经元的活动与感觉输入、情绪反应、运动及睡眠向觉醒的转换相关，而光遗传学激活该群神经元可分别从NREM和REM睡眠中诱导觉醒。相比之下，LH-MCH神经元在REM睡眠期放电频率最高，在觉醒和NREM睡眠期则相对较低。下丘脑视前区（POA）的抑制性神经元包含睡眠活跃群体，其优先在NREM和/或REM睡眠期放电，并已被证实参与睡眠稳态的调控。

图片来源：Nature (2007)

主流模型认为，调控睡眠-觉醒状态的下丘脑神经元可聚类为觉醒活跃群、NREM睡眠活跃群或REM睡眠活跃群，这与经典c-fos染色、电生理学或基于群体的钙活动记录的研究结果一致，提示这些功能集群内的神经元在反复的睡眠-觉醒转换中具有高度稳定性。

图片来源：PNAS (2023)

近日，《Nature Communations》杂志在线刊登了瑞士伯尔尼大学Antoine Adamantidis课题组的最新重要工作，该研究在自由睡眠小鼠中，对LH和POA内基因靶向的促觉醒及促睡眠神经元亚群（LH-Vgat、LH-Vglut2、LH-Hcrt/OX、LH-MCH及POA-Vgat）进行了连续多日睡眠-觉醒状态转换下的纵向在体单细胞钙成像。

通过对跨多日各睡眠状态下神经元活动进行分类与追踪，并结合睡眠剥夺实验，他们发现，尽管状态依赖性功能群体的总体数量保持稳定，但相当比例的单个神经元在不同日间时段其所属类别发生了漂移。睡眠剥夺并未明显干扰神经元群体的稳定性。然而，给予睡眠药物地西泮后，单细胞状态选择性及活动模式显著改变，同时POA中编码NREM睡眠的神经元群体稳定性也受到强烈影响。

LH亚群呈现睡眠状态差异性活动

本研究采用纵向单光子钙成像联合同步脑电/肌电记录，在自由行为小鼠中表征了LH区GABA能（LH-Vgat）、谷氨酸能（LH-Vglut2）、下丘脑泌素/食欲素（LH-Hcrt/OX）及黑色素聚集激素（LH-MCH）神经元的单细胞活动（图1a、b；补充图1）。

作者将Cre依赖性AAV-Syn-flex-GCaMP6注射至Vgat-Cre小鼠LH区以实现特异性标记（图1a；补充图1a）。在3天基线记录中，他们发现LH-Vgat神经元REM期Ca²⁺事件频率较NREM期及觉醒期显著升高（图1c、e）。作者按各状态活动峰值将LH-Vgat神经元分为觉醒最大（45%）、REM最大（30%）、NREM最大（8%）及无调节（17%）四类（图1d），他们观察到该模式在各记录时段中保持一致（图1f）。

类似地，作者在Vglut2-Cre小鼠LH区表达GCaMP6（图1g、h；补充图1a），他们发现多数神经元在觉醒期（59%）或REM期（21%）优先激活（图1i）。他们还发现LH-Vglut2神经元REM期Ca²⁺事件频率最高，觉醒期次之，NREM期最低（图1g、j），且该模式在各时段保持一致（图1k）。

然后，他们通过注射AAV1/2-hORX-GCaMP6s实现LH-Hcrt/OX神经元标记（图1l、m；补充图1b），他们观察到多数神经元在觉醒期优先激活（60%），少数在REM（18%）或NREM（3%）期活跃（图1n）。他们发现觉醒期与REM期Ca²⁺事件频率相近，均显著高于NREM期（图1l、o），且各时段保持一致（图1p）。

他们还在MCH-Cre小鼠LH区注射AAV-Syn-flex-GCaMP6以标记LH-MCH神经元（图1q、r；补充图1b），他们发现REM期优先激活者占40.5%，觉醒期优先者占36.5%，NREM期仅占7.5%（图1s）。他们观察到REM期Ca²⁺事件频率显著升高，觉醒及NREM期维持极低水平（图1q、t-u）。

那么，单细胞水平结果如何呢？

笔者注：睡眠可分为两种核心状态：非快速眼动睡眠（NREM）和快速眼动睡眠（REM）。NREM睡眠通常被视为睡眠的起始阶段，其脑电活动以高幅慢波为特征，机体处于深度休息状态，代谢率降低，心率和呼吸趋于平稳。REM睡眠则表现为脑电去同步化、快速眼球运动及骨骼肌张力显著抑制，此阶段与梦境形成密切相关。两者在整个睡眠周期中交替出现，共同参与记忆巩固、脑内代谢废物清除及神经可塑性的调节。

图1 LH亚群呈现睡眠状态差异性活动

单个神经元睡眠状态特异性随时间发生漂移

上文已知，LH各亚群在各状态下的总体活动频率保持稳定，作者进一步探讨了单个神经元是否维持稳定的状态特异性活动。他们在7天纵向成像中追踪了各LH亚群单个神经元的选择性（图1b），并验证了视野跨日稳定性（补充图3）。

作者发现，首次与第二次成像间，LH-Vgat中仅58.0%觉醒、14.3%NREM和57.9%REM活跃神经元保持原分类，其余神经元的活动峰值转变为其他警觉状态（图2a；补充图4a）。他们在LH-Vglut2、LH-Hcrt/OX及LH-MCH神经元中观察到类似漂移模式（图2b-d；补充图4b-d）。他们还采用互补方法验证了该重组：阈值分类法与跨所有状态分析Ca²⁺事件率的独立分类法（补充图5a-c）。

然后，作者采用三角状态空间框架计算选择性指数，发现两种神经元类型均呈等级化状态选择性，多数神经元位于状态空间中间位置（补充图6a、d），跨时段变异性揭示状态表征持续漂移（补充图6b-f）。

生存分析结果显示，7天后仅极少数神经元保持初始状态选择性（LH-Vgat：4/509，LH-Vglut2：1/257，LH-Hcrt/OX：6/425，LH-MCH：0/28）（图2e-h）。平均每个神经元在21个时段中发生约10次状态转换（图2i-l）。计算转移概率矩阵发现，转换并非完全随机，但也不遵循强烈的时间序列，可能主要由状态占用率驱动（补充图7）。

他们观察到，LH-Vgat、LH-Vglut2和LH-Hcrt/OX中初始觉醒活跃神经元较REM或NREM活跃者更稳定（图2m-o），而LH-MCH中初始REM活跃者稳定性更高（图2p），这与较大集群细胞停留更久的观察一致（图2e-h；补充图7）。

再然后，作者还检验了活跃觉醒是否影响上述漂移。以LH-Vgat为代表，剔除活跃觉醒（占觉醒时间70.8%-97%）后，觉醒期活动下降，NREM和REM不受影响，部分神经元重新分配至其他集群，但平均转换次数无显著变化（11.58 vs 11.06）（补充图8）。结果表明动态重组并非源于觉醒期行为异质性，作者后续将觉醒视为单一状态。

笔者注：生存分析（survival analysis）最初源于医学和生物学研究，用于评估某个事件（如死亡、失效或状态切换）发生前所经历的时间。

在本研究中，作者借助生存分析来考察单个神经元在7天连续记录期间能够维持其初始状态选择性（即保持在同一觉醒活跃、NREM活跃或REM活跃分类中）的时间长度。通过追踪每个神经元首次偏离初始类别的时间点，并计算其“存活”曲线，作者得以量化状态选择性的稳定性与动态重组的速率。分析结果表明，绝大多数神经元的初始状态选择性在数天内即告丧失，仅有极少数细胞能够维持整个记录周期，这为神经元睡眠状态表征的时间漂移提供了定量证据。

图2 单个神经元睡眠状态特异性随时间发生漂移

睡眠状态依赖性神经元群体随时间保持稳定

接下来，作者考察了各LH亚型中睡眠状态活跃神经元的分布是否在群体水平上保持稳定。他们发现，尽管单个神经元频繁在觉醒、NREM和REM间转换（图3a），LH-Vgat神经元中觉醒期（44.3±4.4%）、NREM期（8.6±3.2%）和REM期（27.4±5.8%）活跃的总体分布在21个记录时段中保持稳定（图3e）。该稳定性同样适用于LH-Vglut2、LH-Hcrt/OX和LH-MCH亚群（图3b-d、f-h），表明集群水平组织在单细胞动态漂移中仍维持稳定。

然后，他们通过计算介数中心性分析了细胞集群间的功能互连性。介数中心性衡量神经元作为网络“桥梁”的频率，高介数网络表明更有序的组织结构，介数变异性则反映连接随时间的不稳定性（图3i）。对LH-Vgat、LH-Vglut2和LH-Hcrt/OX（LH-MCH因数量不足未纳入）计算发现，各状态间介数中心性相对可比，分布大体重叠且接近随机水平（图3j-l）。少数神经元显示较高介数值，提示存在有限枢纽样神经元，但大部分神经元与随机水平无显著差异，表明群体内部互连程度有限，缺乏持久功能组织。

他们还发现三个LH亚群的介数变异性在各状态间呈均匀分布，中位值均超随机水平（图3m-o），反映网络随时间持续重构，与单细胞动态漂移结论一致。

为确定活动是否受睡眠稳态影响，作者对动物实施4小时睡眠剥夺（SD）。SD导致恢复期NREM增加、觉醒减少、慢波活动增强（补充图9c、d）。单细胞水平观察到状态依赖性Ca²⁺事件率变化（补充图9e），但动物水平平均后差异不显著，仅LH-Vgat REM活动下降例外（补充图9f）。Ca²⁺瞬变积分及活跃神经元比例在SD后基本不变（补充图9g、h）。综上，LH亚群群体水平活动在SD后保持稳定，单细胞活动呈异质性调节，提示网络对睡眠稳态具有抗扰动能力。

那么，下丘脑其他核团结果如何呢？

图3 睡眠状态依赖性神经元群体随时间保持稳定

POA GABA能神经元呈现与LH神经元相似的动力学特征

随后，作者检测了位于下丘脑前部（POA）的促睡眠神经元是否也存在类似的单细胞动力学特征与群体水平稳定性。他们将AAV-Syn-flex-GCaMP6立体定位注射至Vgat-Cre小鼠的视前区（POA-Vgat）（图4a；补充图1c），并采用与图1b相同的纵向成像方案监测Ca²⁺瞬变及脑电/肌电信号（图4b）。

外侧POA-Vgat神经元以觉醒活跃为主，其中53%的神经元在觉醒期显示最大事件率，26.4%在REM睡眠期选择性激活，8.6%在NREM睡眠期激活，另有12%保持低活动状态（图4c）。无论分类如何，POA-Vgat神经元在REM睡眠期呈现显著较高的Ca²⁺事件频率，在觉醒和NREM睡眠期则保持较低水平，其中觉醒期活动高于NREM期（图4d、e）。

与LH神经元相似，作者发现外侧POA-Vgat神经元初始状态选择性迅速丧失，仅少数觉醒选择性神经元（12/442个细胞）在7天记录后仍维持原分类（图4f、g；补充图4e及图5）。单个POA-Vgat神经元在21个记录时段中平均发生约9.7次状态选择性转换（图4h）。尽管单细胞水平存在动态重组，睡眠-觉醒状态下神经元活动谱的总体分布在群体水平随时间保持稳定（图4i-j）。

上述结果表明，所观察到的状态选择性漂移不局限于特定下丘脑亚区或神经元亚型，而更可能反映本研究所检测的下丘脑网络的一种普遍组织特征。

图4 POA GABA能神经元呈现与LH神经元相似的动力学特征

地西泮在ZT12时增加POA-Vgat神经元活动及其对NREM睡眠的选择性

最后，为探究药理学诱导的睡眠结构改变是否影响外侧POA-Vgat神经元的状态依赖性活动，作者记录了这些神经元对地西泮（DZP）的反应。他们在睡眠压力最低的ZT12时间点给予单次腹腔注射DZP（5 mg/kg），结果如预期，NREM睡眠延长、觉醒减少，慢波峰峰振幅显著降低但数量未变（图5a-e）。重要的是，作者发现DZP通过招募低活动神经元或将觉醒活跃神经元转换为NREM活跃类别，显著增加了NREM期POA-Vgat神经元比例（图5g、h）。此外，DZP在细胞水平显著提高了NREM期Ca²⁺事件率，动物水平亦呈显著趋势（图5f、i）。与对照组相比，DZP后NREM向觉醒转换期间NREM相关活动受到抑制（图5j）。

相比之下，在睡眠压力较高的ZT0给予DZP时（补充图10a-c），作者发现NREM相关Ca²⁺瞬变及三类活跃神经元分布与对照组无显著差异，仅非活跃神经元增加（补充图10d、e）。REM期Ca²⁺事件频率降低（补充图10f、g），但NREM相关活动无显著变化。连续3天DZP给药期间，单细胞动力学与群体稳定性保持完整（补充图10h、i）。

然后，他们进一步探究DZP是否调节LH神经元活动，分别在ZT0或ZT12对LH-Vgat和LH-Hcrt/OX神经元成像（补充图11）。在LH-Vgat神经元中，DZP导致ZT0时REM活跃神经元比例显著降低，ZT12时亦有较小程度降低，同时REM期Ca²⁺事件频率下降（补充图11a-f），但DZP在几乎所有动物中均显著抑制REM时长。与POA-Vgat不同，LH-Vgat在ZT12时NREM活跃神经元及NREM相关Ca²⁺活动仅呈方向性增加。LH-Hcrt/OX神经元在两个时间点均反应微弱（补充图11g-l）。

综上，作者表明DZP在ZT12时选择性增加POA-Vgat中NREM活跃神经元比例，ZT0时无此效应，LH-Vgat中亦见非显著趋势。ZT0给药后POA低活动神经元增加，LH中亦有较小程度增加。上述发现表明不同脑区和状态对药理学调节具有差异化敏感性。

笔者注：地西泮（Diazepam，简称DZP）属于苯二氮䓬类药物，是临床上常用的镇静催眠、抗焦虑及肌肉松弛剂。其作用机制在于与中枢神经系统中γ-氨基丁酸A型（GABAA）受体的苯二氮䓬结合位点结合，增强GABA介导的氯离子通道开放频率，从而强化抑制性突触传递，产生镇静催眠效应。在睡眠调控研究中，地西泮被广泛用作工具药以诱导NREM睡眠，因其在低睡眠压力时段给药可显著延长NREM睡眠时长，而不改变慢波数量，为探究神经网络对药理学干预的响应提供理想模型。

图5 地西泮在ZT12时增加POA-Vgat神经元活动及其对NREM睡眠的选择性

本文的局限性

本研究虽系统揭示了PO核团在丘脑出血后疼痛–抑郁共病中的关键作用及偏侧化机制，但仍存在以下局限性：

第一，本研究采用基于GCaMP的钙成像技术监测神经元活动，该技术通过荧光信号间接反映胞内钙浓度变化，而非直接测量动作电位发放。钙信号在时间分辨率上存在固有局限，难以精确捕捉稀疏放电及高频爆发式活动，且可能低估部分神经元在特定状态下的真实活动水平。此外，病毒注射的表达效率及光学成像的穿透深度限制了可记录神经元的范围，所观察到的漂移现象是否适用于所有下丘脑亚区及未能标记的神经元群体，尚需进一步验证。

第二，本研究所记录的各亚群神经元数量存在较大差异，尤其LH-MCH神经元因数量不足而未能纳入介数中心性等网络分析。此外，不同标记群体之间在GCaMP表达水平、基线荧光强度及动态范围方面可能存在系统性差异，这在一定程度上影响跨群体比较的准确性。

第三，作者将觉醒状态作为单一类别进行分析，不同觉醒模式在行为学意义及神经调控机制上存在本质差异，可能掩盖某些状态依赖性的精细调节模式。结合行为学视频的分类方法有助于未来研究揭示更精细的活动模式。

第四，药物干预实验仅使用了一种GABA能阳性变构调节剂地西泮，且仅检测了单一剂量。不同剂量、不同作用机制的促睡眠药物（如褪黑素受体激动剂、食欲素受体拮抗剂等）是否同样诱导神经元状态选择性的重组，以及该效应是否具有药物类别特异性，均有待系统研究。

总结

相关性及因果性证据表明，基因定义明确且进化保守的不同下丘脑神经元亚群分别参与觉醒、非快速眼动睡眠及快速眼动睡眠的调控。主流观点认为，这些神经环路通过募集稳定且不变的神经元底物来调控睡眠-觉醒状态，然而这一假设尚未得到证实。

本研究通过在自由活动睡眠的雄性小鼠中进行纵向单细胞钙成像，发现下丘脑中抑制性、兴奋性、下丘脑泌素/食欲素表达及黑色素聚集激素表达神经元并未表现出稳定的状态特异性活动。相反，其活动模式随时间的推移在睡眠-觉醒状态之间发生漂移，而各睡眠状态下活跃神经元的分布则保持稳定。虽然睡眠剥夺对这些活动模式的选择性影响甚微，但作者发现促睡眠药物地西泮募集了先前处于非活跃状态或觉醒活跃状态的NREM睡眠活跃细胞。

这些发现表明，尽管单个神经元的活动呈现动态的、状态依赖性的漂移，但睡眠-觉醒神经群体的整体组织结构保持稳定。

参考文献

Yan, Y., Calcini, N., Rusterholz, T. et al. Temporal drift of sleep-wake representations in hypothalamic neuronal ensembles. Nat Commun (2026). https://doi.org/10.1038/s41467-026-75792-1.

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