系统盘点非临床研究中的生物标志物

生物标志物在非临床药物开发中的应用涵盖多个学科、多种技术平台和不同研发阶段，从药物靶点的识别与评估，一直延伸到临床试验期间对研究性药物相关问题的解决。美国国立卫生研究院（NIH）将生物标志物定义为：可客观测量并作为生物学过程或药理反应指标的特征。在非临床药物开发情景下，生物标志物可进一步定义为：任何可被客观测量和评估的特定参数，用于反映正常生理过程、病理过程或对药物/受试物的药理反应，从而辅助疾病诊断、监测或评估治疗干预效果。

在安全性评价中，生物标志物最常用于早期毒性信号的监测，因此常被称为“安全性生物标志物”。然而，在药物发现阶段，科学家也认识到生物标志物用途更广，它们有时也可作为疗效评估的分子指标。例如，HER2在约20%的乳腺癌中高表达，与肿瘤侵袭性强相关，但同时也是多种有效乳腺癌靶向药物的作用靶点。

生物标志物分类

在非临床药物开发中，生物标志物通常分为三类：

1.暴露生物标志物（Biomarkers of Exposure）

指在特定组织或体液中检测到的受试药物本身或其代谢产物，用以证明机体已接触该物质。比如，对乙酰氨基酚经代谢生成活性中间体NAPQI。两者均可作为暴露标志物。但在对乙酰氨基酚过量时，NAPQI水平更多地被用作毒性程度或解毒剂（如N-乙酰半胱氨酸）疗效的效应标志物。说明，同一标志物在不同情境下可能兼具暴露与效应双重属性，分类需结合具体背景理解。

2.易感性生物标志物（Biomarkers of Susceptibility）

指个体因携带特定基因型而对某种疾病更易感，或对特定药物反应更强。
例如，抗凝药华法林通过抑制维生素K依赖性凝血因子发挥作用。携带CYP2C92或CYP2C93等位基因的患者，其华法林代谢能力下降，血药浓度升高，出血风险增加。通过基因分型可识别高风险人群，从而调整剂量。这类标志物有助于选择合适的动物疾病模型，理解特定单倍型下的毒代动力学，在早期临床试验中筛选合适受试者。

3.效应生物标志物（Biomarkers of Effect）

包括药效动力学（疗效）标志物和毒性（安全性）标志物，反映药物给药后在受体、组织或体液中引起的特定改变或损伤。

理想的效应标志物应具备：可客观测量；与药物作用相关；微创或无创获取（如唾液、尿液、血液、血浆或影像学手段），优于需活检等侵入性方法。

识别效应标志物需深入理解：特定组织中的效应通路；信号通路及其与机体其他系统的相互作用。比如，生长激素由垂体前叶分泌，作用于肝脏生长激素受体，促使血浆中胰岛素样生长因子-1（IGF-1）及其酸不稳定亚基（IGFALS）水平升高。因此，干扰生长激素信号通路的外源物质（如毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇，deoxynivalenol）也会改变IGF-1或IGFALS水平，使其成为评估该通路受扰的循环生物标志物。

要正确解读效应生物标志物数据，必须充分了解受试物与标志物在体内的动力学行为（如吸收、分布、代谢、排泄）。

非临床研究中生物标志物的验证、确证与应用

随着药物研发对精准性和效率的要求不断提高，生物标志物在制药行业和监管机构中的重要性日益凸显。尽管许多传统生物标志物（如常规临床病理指标）已有标准化方法并长期使用，但当前大量新兴生物标志物依赖于较新的免疫分析技术，通常通过市售的商业化试剂盒进行检测。然而，这些试剂盒及其关键试剂缺乏统一监管、监控和标准化，导致不同实验室间数据不一致，甚至误用。因此，严格的分析验证与性能表征至关重要。

一、生物标志物的确证（Qualification）

“确证” ≠ “验证”：

验证（Validation）：指对检测方法或分析系统的性能进行表征（如准确性、精密度等）。

确证（Qualification）：指监管机构在特定条件下（如“可用于大鼠肾毒性评估”）对某一生物标志物用途的正式认可。

美国FDA、欧洲EMA、OECD等已与制药行业就生物标志物确证展开对话。FDA设立了生物标志物确证评审团队（BRQT），负责评估作为IND/NDA申请一部分提交的生物标志物确证数据，推动其在审评流程中的整合应用。

生物标志物确证主要由国际联盟推动，如预测性安全测试联盟（PSTC）和国际生命科学学会健康与环境科学研究所（ILSI-HESI）。这些组织致力于发现、评估并推广有前景的新生物标志物。

不过，即使未获FDA正式确证，只要在非临床研究中反复证明其价值，某些生物标志物仍被广泛用于安全性研究，以提供额外视角。

二、商业化生物标志物试剂盒的挑战

1. 两类主要试剂盒：

多数非临床实验室使用的新型生物标志物试剂盒为RUO产品，其质量、特异性、稳定性常不足以支持药物开发需求。

2. RUO试剂盒的主要问题：

宣传用途过于宽泛（如跨物种、多基质适用），但实际设计未必匹配；缺乏批次间一致性验证；用户端的性能评估流程差异大；因属“研究用途”，无生产或质量监管。

建议：选择信誉良好的供应商；开展针对具体用途的性能表征；在整个非临床项目中保持试剂和方法的一致性。

三、“适用目的”导向的分析验证（Fit-for-Purpose Validation）

为应对上述挑战，行业逐步采纳“适用目的验证”（Fit-for-Purpose）模型（自2006年提出，已应用十余年）。

核心理念：验证的严谨程度应与数据用途的风险等级相匹配。

比如，早期发现阶段（非GLP）对肾毒性标志物的验证要求较低；但是，关键GLP毒理研究（如13周试验，已知心脏风险），对心脏标志物的验证需高度严谨。

验证关键要素包括：制定验证计划；动态范围测试；批内/批间精密度与准确度；稀释线性与平行性；在目标物种基质中建立质控样本；建立正常基线参考范围；基质中短期/长期稳定性评估。验证的深度（如运行次数、稳定性时长、标准曲线点数、批次间差异测试等）取决于对数据可靠性的要求。

FDA 2013年《生物分析方法验证指南》对商业化试剂盒的建议：1）必须在实际检测实验室进行性能评估（site-specific）；2）制造商提供的验证数据不能替代用户端验证；3）必须在实际使用条件下验证特异性、准确性、精密度和稳定性；4）独立制备已知浓度的QC样本（不可仅依赖试剂盒自带材料）；5）标准品与QC样本应使用与受试样本相同的基质；6）若研究中使用多个试剂盒批次，需评估关键试剂的批次间可比性。

尽管这些指南非强制性，但已被大多数实验室采纳为实践标准。

四、非临床研究中生物标志物的应用要点

1. 阳性信号的识别与解读

新型生物标志物的“分析噪声”远高于传统临床病理指标。科学家需同时了解：分析变异（来自验证数据）、生物学变异（通过历史对照数据建立）。解读人员需基于分析验证数据，掌握特定检测/试剂组合的固有变异特征。通过建立目标参考人群的历史对照数据集，明确生物变异范围。识别阳性信号后，需深入理解其生物学意义（如心肌肌钙蛋白（cTnI）反映心肌细胞直接损伤，利钠肽（proBNP）提示心功能缺陷），这是准确识别药物危害的核心。

比如，肾损伤生物标志物NGAL（中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白），既可见于肾小管损伤，也可能在全身性或尿路感染时升高。

2. 生物标志物响应具有异质性

不同化合物、不同机制、不同物种下，同一标志物的响应时间、幅度可能截然不同。比如，化合物A在犬中24小时内使cTnI升高10倍；化合物B在72小时后仅升高2倍。若换用proBNP，时间和幅度模式完全不同。

物种差异显著：急性期蛋白（如CRP、血清淀粉样蛋白A）在不同物种对相同炎症刺激的反应差异极大。

3. 采样时机至关重要

同一炎症刺激下，不同标志物的峰值时间不同：IL-6：6–24小时；CRP：1–2天；纤维蛋白原：2–3天。

若在第3天采样检测IL-6，可能错过信号，导致对药物安全性误判。

五、实验室间与方法间差异

同一生物标志物在不同实验室可能使用不同平台、抗体或试剂盒；

抗体亲和力与特异性差异可导致检测结果相差高达15倍（如肾毒性标志物研究所示）；

缺乏方法间一致性，使得跨实验室数据难以直接比较。

应对策略：每个实验室应建立自身方法/平台的参考范围，避免直接套用文献或其他实验室数据。

肝损伤生物标志物

一、肝脏结构与损伤模式的基础知识

肝脏是维持营养稳态、代谢/解毒及排泄外源性或内源性物质的关键器官。其基本功能包括：合成白蛋白和凝血因子；葡萄糖的合成与储存；胆红素与胆固醇的利用与循环；激素代谢；药物解毒。

肝脏以肝小叶为功能单位，由肝细胞索构成，其间为肝窦，内含窗孔状内皮细胞、库普弗细胞（Kupffer cells）和星状细胞。肝细胞之间有胆小管，用于胆汁运输。

肝小叶内存在氧分压梯度与代谢酶分布梯度：

1区（门周区，Zone 1）：氧含量最高，但细胞色素P450等代谢酶最少；

3区（中央静脉区，Zone 3）：氧含量最低，但代谢酶最丰富；

2区（中间带，Zone 2）：介于两者之间。

这一结构特点决定了不同毒性机制引起的肝损伤具有区域特异性。比如：

对乙酰氨基酚过量：因在3区高表达的P450酶生成毒性代谢物NAPQI，导致中央静脉周围坏死；

铁中毒：依赖高氧环境下的氧化还原反应，主要引起门周区损伤。

这种“分区损伤”模式有助于毒理学家推断损伤机制，并设计针对性研究。

二、药物性肝损伤（DILI）的重要性

DILI是过去三十年药物撤市的主要原因之一，对患者和药企均造成重大影响。非临床安全性评价中，利用生物标志物更早、更准确预测DILI的需求日益迫切。肝损伤形式多样，可涉及不同细胞类型，取决于化合物性质、剂量和暴露时间，常见病理事件包括：肝细胞死亡；胆小管通透性/功能障碍；细胞骨架破坏；脂质蓄积；肝窦功能异常；库普弗细胞激活与炎症；半抗原介导的免疫性肝损伤；纤维化/胶原沉积增加。

需要注意的是，“肝损伤”≠“肝功能异常”。某些情况下，损伤标志物显著升高，但肝功能指标正常，反之亦然。

三、肝损伤生物标志物分类

目前分为两类：

传统标志物：多为常规临床化学指标，广泛用于非临床和临床；

新兴/探索性标志物：尚未标准化或完全确证，但在特定项目中用于深入表征肝损伤。

四、传统肝损伤标志物（推荐组合）

根据当前最佳实践，非临床安全性评价应至少检测4项血清指标：

肝细胞损伤（hepatocellular injury）：任选2项，→ALT、AST、SDH、GLDH

肝胆管损伤（hepatobiliary injury）：任选2项，→ALP、GGT、总胆红素（TBILI）、总胆汁酸（TBA）、5′-核苷酸酶

其中，ALT、AST、ALP、TBILI也用于人类临床，因此使用频率更高。

但需注意，不同实验动物种属间标志物表现差异显著，应结合病理学家意见合理选择。

五、肝细胞损伤标志物详解

1.丙氨酸氨基转移酶（ALT）

别名：ALAT、SGPT；

功能：参与氨基酸代谢与糖异生；

特点：肝细胞损伤后释放入血，敏感且具种属可转化性；是最常用的肝毒性指标；但并非总是与组织病理一致；

可受以下因素干扰：大鼠/犬中酶诱导可致假阳性；肌肉损伤也可轻度升高；维生素B12缺乏、异烟肼或铅（抑制辅酶PLP）可抑制ALT活性，导致假阴性。

临床应用：Hy’s法则——ALT>3×ULN且TBILI>2×ULN，提示严重肝损伤。

非临床参考：“双标志物法则”——ALT>3×ULN+另一肝损伤标志物显著异常，视为肝损伤信号。

注意：人类临床标准不能直接套用于动物（如TBILI在某些动物中不能反映胆汁淤积）；

此外，猪、豚鼠及某些大鼠品系中ALT敏感性较低；短期研究中可能出现“适应性升高”（短暂、无病理意义），需谨慎解读。有研究建议使用ALT1同工酶（肝特异性更强）的免疫检测法，但尚未普及。

2.天冬氨酸氨基转移酶（AST）

别名：SGOT；存在于肝细胞胞浆及线粒体，也大量存在于骨骼肌；肝损伤时释放入血，但特异性低于ALT；AST/ALT比值高可能提示肌肉损伤（如动物保定造成的轻微创伤）。

因AST半衰期较短且部分在线粒体，通常ALT升高幅度大于AST。

解读需结合酶动力学、半衰期及其他数据，由经验丰富的毒理人员综合判断。

3.谷氨酸脱氢酶（GLDH）

线粒体酶，参与尿素循环；肝损伤时升高，幅度可能高于ALT且持续时间更长；不受肌肉损伤或皮质类固醇诱导影响；不易受PLP抑制剂干扰；目前未常规使用，主因可靠试剂有限。

在某些种属中，比ALT/AST更具肝特异性，被视为潜在补充标志物。

4.山梨醇脱氢酶（SDH）

催化山梨醇与果糖之间的可逆反应；对急性肝细胞损伤高度敏感且特异（适用于啮齿类、犬、非人灵长类，甚至人类）；

缺点：半衰期极短（犬约4小时），样本需死后立即分析，稳定性差；

尚无大规模研究证明其比ALT提供额外价值。

5.总胆汁酸（TBA）

胆汁酸参与胆固醇代谢及脂溶性维生素吸收；血清水平受饮食与禁食状态影响；升高可反映肝细胞损伤或肝功能障碍；作为肝细胞功能指标，有助于评估肝损伤的功能后果；在非临床研究中是肝胆系统评估的重要辅助指标。

六、肝胆管损伤的传统生物标志物

1.碱性磷酸酶（ALP）

功能：水解多种蛋白质和核苷酸上的磷酸基团；

临床意义：是肝胆管损伤（尤其是胆汁淤积）的主要标志物；血清ALP升高通常反映胆管通畅性下降。

局限性：

非特异性：骨生长/疾病、糖皮质激素治疗、微粒体酶诱导均可导致升高；

肠道同工酶干扰：在啮齿类动物中，禁食或厌食时ALP活性下降，餐后短暂升高；

同工酶检测虽可区分肝源、骨源或肠源ALP，但在非临床研究中未提供额外诊断价值，通常仍使用总ALP。

2.总胆红素（TBILI）

来源：衰老红细胞中血红蛋白的分解产物，包括结合型（肝内）和非结合型（肝外）；

升高原因多样：胆汁淤积（最常见）；溶血（红细胞破坏增加）；药物抑制UDP-葡萄糖醛酸转移酶（如某些药物干扰胆红素代谢）；肝功能衰竭。

解读需谨慎：必须结合其他数据（如组织病理、其他生化指标）综合判断高胆红素血症的具体机制。

3.γ-谷氨酰转移酶（GGT）

定位：主要位于肝细胞胆小管膜，参与谷胱甘肽循环；

特点：在胆汁淤积时被诱导表达，常用于确认ALP升高是否源于肝脏；在犬和猫中，特异性高于ALP，但敏感性较低。

用途：辅助鉴别ALP升高的来源（肝vs骨）。

4.其他肝胆管标志物

5′-核苷酸酶（5′-NT）和总胆汁酸（TBA）也可用于评估胆道功能；但在非临床研究中，未显示比ALP+TBILI提供更多额外信息，故较少单独使用。

七、新兴肝损伤生物标志物（由PSTC推动确证）

由于传统标志物（如ALT）存在特异性不足、无法定位损伤区域或细胞类型等问题，近年来通过蛋白质组学等方法筛选出一批更具潜力的新型标志物。

PSTC（Predictive Safety Testing Consortium）已将以下标志物纳入分阶段确证计划：

第一组（优先确证）：

1.谷氨酸脱氢酶（GLDH）

定位：主要位于中央静脉区（Zone 3）肝细胞的线粒体；

优势：不受肌肉损伤或糖皮质激素影响；不受吡哆醛-5′-磷酸（PLP）抑制剂干扰；升高幅度可能高于ALT且持续时间更长；

进展：已在人类DILI病例中验证其特异性；已建立人群参考区间。

正从“冷门经典标志物”向常规急性肝损伤检测指标转变。

2.苹果酸脱氢酶（MDH）

定位：主要在门周区（Zone 1）肝细胞胞浆（少量在线粒体）；

功能：三羧酸循环关键酶，催化苹果酸⇌草酰乙酸；

特点：血清水平在肝损伤时升高（但心肌损伤也可升高）；健康人群中性别/年龄差异小；

潜力：因其门周区定位，有望用于识别特定区域损伤，并具备临床转化前景。

3.对氧磷酶-1（PON1）

功能：保护低密度脂蛋白免于氧化，解毒有机磷化合物；

来源：主要由肝脏合成（肾、脑也有少量）；

独特之处：肝损伤时水平下降（因合成/分泌减少），而其他标志物均为升高；

挑战：健康人群基线值受种族影响，跨种属转化尚不明确；

价值：作为“负向标志物”，提供互补信息，正在确证中。

4.嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）

功能：参与嘌呤补救合成通路；

分布：存在于肝细胞、库普弗细胞、内皮细胞的胞浆；

释放机制：肝实质或非实质细胞坏死时释放入血窦；

优势：可检测非实质细胞损伤（如Kupffer细胞激活），是少有的能反映多细胞类型损伤的标志物；

已进入第一轮确证。

第二组（次优先确证）：

1.精氨酸酶-1（ARG-1）

功能：肝特异性水解酶，催化精氨酸→尿素+鸟氨酸；

特点：在探索性研究中显示为早期肝损伤标志物；

现状：尚未纳入常规非临床安全性评价。

2.谷胱甘肽S-转移酶α（GSTα）

背景：GST家族有α、π、μ、θ四种亚型，其中GSTα高表达于中央静脉区肝细胞；

优势：可特异性反映代谢活跃区（Zone 3）的损伤（如对乙酰氨基酚毒性）；具备良好确证前景。

第三组（探索性）：

miR-122（微小RNA）

特性：约22个核苷酸的非编码RNA；肝脏高度特异性表达（占肝miRNA的70%以上）；药物过量时血中水平显著升高；

优势：稳定性高（不易降解）；可用高灵敏度qPCR检测，优于传统比色法；

局限：目前DILI相关证据有限；

潜力：作为首个核酸类肝损伤标志物，代表未来发展方向。

肾损伤生物标志物

一、背景与挑战

肾毒性（Nephrotoxicity）和急性肾损伤（AKI）是非临床安全性研究中的常见问题，也是导致新药研发失败的主要原因之一。

肾脏易损原因：接受高达25%心输出量的血流，暴露于高浓度药物/代谢物；肾小管在尿液浓缩过程中进一步富集毒性物质。

常见肾毒性物质：重金属（铬、铅、汞）；非甾体抗炎药（如对乙酰氨基酚）；氨基糖苷类抗生素（如庆大霉素）；免疫抑制剂与化疗药（如环孢素、顺铂）。

二、传统肾功能指标的局限性

常用指标：血尿素氮（BUN）、血清肌酐（sCr）、血磷、尿比重；

主要缺陷：1）敏感性低：需65–75%肾功能丧失后才出现明显变化；2）无法早期预警或定位损伤部位。不足以满足非临床研究中对早期、特异性肾损伤检测的需求。

三、新一代肾损伤生物标志物的发展

为提升检测灵敏度与特异性，PSTC和ILSI-HESI等国际协作组织推动了新型肾损伤标志物的研发与确证。

1.FDA首批确证的7种尿液标志物（用于大鼠）

可与BUN/sCr联合使用，用于监测药物性肾损伤：KIM-1（肾损伤分子-1）、白蛋白、总蛋白、β₂-微球蛋白（B2M）、胱抑素C（CystatinC）、Clusterin（簇集素）、TrefoilFactor-3（TFF3）。

2.后续新增确证标志物

Clusterin和肾乳头抗原-1（RPA-1）被FDA/EMA接受，用于检测大鼠急性肾小管病变。

3.其他广泛应用的标志物（虽未全部获官方确证，但已在药物开发中使用）：骨桥蛋白（Osteopontin）、NGAL（中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白）、GST-α、Calbindin（钙结合蛋白）。

四、尿液生物标志物检测的技术要点

样本采集：必须使用代谢笼收集尿液；避免食物、垫料、粪便等污染，防止前处理变异。

数据标准化：尿液浓度波动大，必须进行校正：1）肌酐比值法（analyte/creatinine）；2）定时尿量法（如analyte/16小时尿量）。

采样时间：通常在预期肾损伤后2–3天内收集12–16小时尿；部分标志物（如NGAL、KIM-1）可在损伤后数小时内升高。

五、肾损伤标志物的分类与解读原则

传统分类：按肾单位节段（近端小管、肾小球、集合管）；

最新认识：多数标志物存在节段重叠，更合理的分类是：肾小管损伤标志物、肾小球损伤标志物。

选择标志物时需考虑：检测方法可用性；实验动物种属；预期病理机制（如是否影响滤过或重吸收）；标志物稳定性；与组织病理学（金标准）的相关性。所有新兴标志物的性能评估仍以光镜下的肾组织病理改变为参照标准。

六、主要肾小管损伤标志物详解

1.KIM-1（Kidney Injury Molecule-1）

性质：85kDa I型跨膜糖蛋白，高度保守（人、猴、犬、大鼠均有）；

定位：经典近端小管标志物；

释放机制：损伤后从上皮细胞脱落入尿；

优势：早期、敏感，适用于多种损伤模型（毒性、缺血、移植等）；在人类中可预测不良预后；

应用现状：广泛用于大鼠和非人灵长类；犬中可能无效（有争议）；

多数多因子检测平台已包含KIM-1。

2.NGAL（中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白，Lipocalin-2）

来源：正常由中性粒细胞产生；肾损伤时在近端与远端小管显著上调；

机制：肾脏合成增加+近端小管重吸收障碍→尿中NGAL升高；

优点：早期检测急性小管损伤；

局限性：非特异性，炎症、感染（如尿路感染）、肿瘤等可致假阳性；

尚未获FDA正式确证，但广泛用于非临床研究。

3.Clusterin（簇集素）

性质：76–80kDa蛋白，在损伤后于去分化小管细胞表达；

功能：抗凋亡、细胞保护、脂质回收、细胞黏附；

特点：升高见于近端与远端小管损伤；不升高于肾小球病变；

已被FDA/EMA接受用于大鼠肾小管损伤检测。

4.胱抑素C（CystatinC）

特性：13.3kDa，由所有有核细胞恒定分泌；自由经肾小球滤过，完全被近端小管重吸收；

双重用途：

血清水平：反映肾小球滤过率（GFR），不受年龄、性别、肌肉量影响；

尿液水平：仅在近端小管功能障碍时升高；

优势：PSTC研究显示，尿胱抑素C比BUN/sCr更早发现肾小管重吸收异常。

5.酶尿（Enzymuria）

代表酶类：碱性磷酸酶（ALP）、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）、γ-谷氨酰转移酶（GGT）、谷胱甘肽S-转移酶（GST）

特点：来源于受损的近端/远端小管细胞；敏感性高，早于sCr升高；多通过常规生化分析仪检测（非免疫法）；

现状：被视为“传统”标志物，未归入“新一代”，但在动物研究中仍有价值。

七、肾小球损伤标志物

主要指标：总蛋白、白蛋白、微球蛋白（α₁、β₂）

生理机制：肾小球滤过屏障通常阻止>白蛋白（~36Å）的大分子通过；小分子蛋白（如β₂-微球蛋白）可滤过，但被近端小管重吸收。

损伤解读：白蛋白/大分子蛋白↑→肾小球损伤（滤过屏障破坏）；

β₂-微球蛋白↑→近端小管重吸收障碍（即使肾小球正常）；

临床价值：对多种病因引起的肾损伤具有良好的敏感性与特异性。

肾损伤生物标志物总结如下表：

八、未来方向

单一标志物难以满足复杂需求：肾脏结构功能复杂；药物毒性机制多样；

发展趋势：采用多标志物组合面板（血+尿）；用于早期筛查、机制研究、种属外推、临床监测；

标志物选择原则：基于充分的科学证据；明确其适用场景（种属、损伤类型、检测窗口）；与组织病理结果高度关联。

心脏和骨骼肌损伤生物标志物

一、心脏毒性概述及生物标志物分类

毒性诱因：多种外源性物质及化学治疗药物可引发心脏毒性，包括抗心律失常药（如β受体阻滞剂）、正性肌力药（如地高辛、异丙肾上腺素）、麻醉药（如异氟醚、丙泊酚）、麻醉镇痛药（如可卡因）及抗肿瘤药（如多柔比星、环磷酰胺）。

分类界定：心脏毒性生物标志物需与心血管/药物诱导血管损伤（DIVI）生物标志物区分，后者聚焦血管及血管系统损伤。

核心分类：

心脏结构损伤/坏死标志物：如肌钙蛋白、脂肪酸结合蛋白，用于检测心肌细胞直接损伤及坏死；

心脏功能改变标志物：如利钠肽，用于提示心功能异常。

本文聚焦血液及体液（血清/血浆）中的生物标志物检测，该方法在非临床研究及毒理学研究中应用更为广泛（其他检测手段如心电图、影像学检查、血压/心输出量等功能评估暂不展开）。

二、心脏结构损伤与坏死生物标志物

三、心脏功能改变生物标志物（利钠肽家族）

家族成员：包括心房利钠肽（ANP）、脑利钠肽（BNP）及其N端前体（NT-proANP、NT-proBNP），其中NT-proBNP在非临床毒理学研究中应用最广泛。

作用机制：由心肌细胞分泌，具有血管活性及利尿作用，参与血压调节、肾功能稳态及心输出量维持；心肌壁受牵拉时快速释放至循环。

临床意义：

诊断价值：对人及动物心力衰竭的诊断灵敏度和特异性高，与心室收缩功能障碍呈正相关；

适用场景：可用于扩张型/肥厚型心肌病、舒张功能障碍、全身性高血压等心血管疾病的预后评估；

局限：非心脏疾病（如肺栓塞、肝硬化、肾病、甲状腺功能亢进）也可能导致其升高（与血管容量及血压增加相关）。

药物安全性评价应用：需与cTnI等心脏结构损伤标志物联合使用，全面表征药物对心脏结构及功能的双重影响。

四、骨骼肌损伤生物标志物

损伤诱因：常见于非临床安全性研究，如暴露于胆碱酯酶抑制剂（如克百威）等化合物，或医疗器械研究中的手术操作。

传统标志物：

肌酸激酶（CK）：

分布：骨骼肌、心肌、脑组织中含量较高，胃肠道、子宫、膀胱、肾脏中少量存在；

优势：细胞损伤后快速释放，半衰期短（犬仅2小时），是检测全身性肌肉损伤的最常用标志物；

isoenzymes：包括CK-MM（骨骼肌为主）、CK-BB（脑组织为主）、CK-MB（心肌为主），但心肌及骨骼肌中均以CK-MM为主，且肌型、物种、肌肉部位间的CK含量及同工酶比例差异大，CK-MB单独使用缺乏心脏特异性；

乳酸脱氢酶（LD）：组织分布广泛（骨骼肌、心肌、肝脏、红细胞等），特异性低，可作为骨骼肌及肝脏损伤的辅助标志物，其同工酶（LD1、LD2等）的心脏特异性提升效果有限；

AST/ALT：多器官分布（含骨骼肌、肝脏），AST升高与肝、骨骼肌损伤及溶血相关，严重肌肉损伤也可能导致ALT升高。

新一代标志物：骨骼肌肌钙蛋白I（sTnI）

优势：灵敏度及特异性高，与心肌肌钙蛋白I（cTnI）抗原性不同，可有效区分骨骼肌与心肌损伤（如大鼠中已通过多种心脏毒素、霉菌毒素验证）；

应用：已纳入多重肌肉损伤检测，用于鉴别心脏与骨骼肌损伤。

血管损伤生物标志物

一、药物诱导血管损伤（DIVI）概述

定义：指多种病理过程导致的血管损伤，是药物研发失败的重要原因。非临床研究中发现DIVI风险后，药企通常不会推进至临床阶段。

诊断基础：非临床动物模型中，DIVI诊断主要依赖三类生物标志物：内皮细胞（EC）黏附分子释放相关标志物、EC活化标志物、非特异性急性期炎症蛋白。

核心挑战：

物种特异性限制：多数潜在标志物无法同等适用于所有动物物种及损伤类型，且缺乏针对所有DIVI标志物的物种特异性检测方法；

转化难度大：人类血管疾病机制（如免疫介导）与多数非临床动物DIVI机制（如血流动力学改变、直接内皮细胞毒性）存在显著差异，导致跨物种转化的生物标志物筛选难度较高。

关键研究：PSTC血管损伤工作组（VIWG）在大鼠模型中开展了迄今为止最具影响力的DIVI相关研究，目标是筛选出可向人类转化、且不依赖病理生理机制的候选生物标志物。

二、DIVI核心生物标志物分类及特性

VIWG通过研究数十种蛋白质及分子标志物，最终确定两类核心候选标志物：内皮细胞活化/损伤标志物、炎症相关标志物。

免疫系统生物标志物

一、免疫系统基础与免疫毒性分类

系统特性：免疫系统是由屏障、特异性效应细胞及分子构成的复杂调控网络，核心功能为区分“自身”与“非自身”；功能上分为先天免疫（无需免疫记忆，含解剖/生理屏障、吞噬细胞等）和适应性免疫（需抗原暴露形成免疫记忆，包括体液免疫和细胞免疫）。

核心挑战：系统复杂性、功能冗余性及显著的物种差异，增加了非临床免疫安全性评价难度（如抗CD28单克隆抗体的I期临床试验出现全身性器官衰竭，非临床研究未预测到）。

免疫毒性分类：外源性物质导致的免疫系统损伤/改变可分为5类：

免疫抑制、超敏反应、免疫原性、自身免疫、不良免疫刺激；

注：化学物质与生物制品的分类框架类似，但分子量是免疫原性的关键决定因素（分子量＜1000Da的物质通常无免疫原性，除非其代谢产物以半抗原形式结合内源性分子）。

二、免疫系统生物标志物检测策略

采用分层检测方法，核心包括三类技术手段：

基础检测流程：先通过血液学、临床化学面板、淋巴器官重量及组织形态学评估筛选信号，再根据需求开展宿主抵抗力、迟发型超敏反应、自身免疫等针对性检测。

三、免疫抑制的核心标志物与评估指标

（一）基础检测指标

（二）免疫功能专项研究（分层开展）

四、免疫刺激的核心标志物

某些化合物可过度激活免疫系统，引发一系列非预期效应，包括：细胞因子释放、多组织白细胞浸润、补体激活、慢性炎症。

常见于以下产品：疫苗、佐剂、医疗器械、单抗。

这些物质常引起典型的炎症/免疫激活反应，如：中性粒细胞、淋巴细胞增多；急性期蛋白（APP）升高（如纤维蛋白原、C反应蛋白）；细胞因子及其他炎症标志物上升。

必须通过其他手段（如机制研究、种属比较）深入理解免疫刺激的作用机制，以科学评估其对人类的潜在风险。

常规检测手段

1.血液学检查（Hematology）

可检测典型免疫/炎症反应：白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞增多

常伴随组织学改变：骨髓增生、淋巴器官增生、脾脏髓外造血、其他炎症性病变

2.临床生化检查（ClinicalChemistry）

白蛋白（负性APP）：炎症时下降

球蛋白（正性APP）：炎症时上升

→两者对免疫/炎症信号均较敏感

此外，多数生化或凝血分析仪还可检测：C反应蛋白（CRP）、纤维蛋白原、血清淀粉样蛋白A（SAA）。→有助于识别促炎状态

急性期蛋白（Acute-Phase Proteins, APPs）

主要由肝脏在上游炎症信号刺激下合成，是免疫系统扰动的优秀生物标志物。分为两类：1）正性APP：随炎症升高（如CRP、纤维蛋白原、SAA）；2）负性APP：随炎症降低（如白蛋白）。

APPs的种属差异至关重要。不同物种中，APP的“主次”地位不同（如下表所示）：

非人灵长类：CRP是主要APP，炎症时显著升高；

啮齿类（大鼠/小鼠）：CRP反应微弱甚至无，应选用其他APP（如SAA）；

错误选择APP会导致对药物风险的误判。

动态特征：多数APP在炎症刺激后24–72小时达峰；采血时间点设计和结果解读需考虑此时间窗；必须结合其他炎症指标（如血常规、细胞因子）综合判断。

细胞因子评估（Cytokine Evaluation）

细胞因子是细胞间信号分子，调控激活、增殖、分化、迁移、凋亡等免疫过程。用于危害识别、机制解析、药效/药动学生物标志物、药物不良反应监测。

挑战与局限：半衰期极短，释放与清除迅速；无器官特异性；基线水平常低于检测限；缺乏标准化检测方法；免疫系统高度复杂→需有针对性、有策略地设计实验。

采样建议（动物非临床研究）：细胞因子通常在给药后2–24小时内升高，早于APP（24–72h）；推荐在24小时内多次采样，例如给药后2–6h、12h、24h。

具体方案应根据研究目的、药物已知药理特性、预期免疫反应类型而定。

常用检测指标

基础指标：IL-1、IL-6、TNF-α、IFN-γ

扩展指标：MCP-1、VEGF、IL-2、IL-4、IL-8/KC/GRO、IL-10、IL-12、IL-13

种属转化问题：动物体内细胞因子反应未必能预测人类不良反应；例如，TGN1412事件显示动物模型未能预警严重细胞因子风暴。

解决方案：细胞因子释放试验（Cytokine Release Assays,CRAs）

目的：弥合动物与人类反应差异，提升预测性；

方法：从人或动物外周血分离PBMC（外周血单个核细胞）或使用全血；与受试化合物共孵育（溶液相或固相包被）；在6–72小时内检测上清中细胞因子水平。

全血vs PBMC之争

全血CRA优势：更接近体内环境（含血小板、可溶性因子、多种细胞）；操作更简便；行业现状是约62%采用溶液相CRA（多为全血）；固相CRA（如TGN1412案例）在某些情况下预测性更强。

五、超敏反应（Hypersensitivity）的指标

1.I型超敏反应（速发型）

机制：主要由IgE介导（人类及多数动物）；

但在豚鼠、兔、大鼠、小鼠中，IgG也可介导全身性过敏反应（anaphylaxis）；

表现：1）全身性：过敏性休克、荨麻疹；2）呼吸道：哮喘；3）介质释放：组胺、激肽、5-羟色胺等血管活性胺；

监管要求：1）FDA要求所有吸入给药药物必须评估I型超敏风险；2）治疗性蛋白在猴等动物中也可能诱发I型反应；3）但需考虑蛋白来源种属对风险评估的影响。

关键指标：1）药物特异性IgE（无论是否伴Th2细胞因子升高）即视为风险信号；2）Th2细胞因子：IL-4、IL-5、IL-10、IL-13。

局部淋巴结试验（LLNA）已广泛取代豚鼠致敏试验；通过皮肤接触测试化学物致敏性；判定标准：局部淋巴结淋巴细胞增殖≥对照组3倍；

注意：小鼠皮肤比人类更薄、通透性更高→外推至人需谨慎。

2.II型与III型超敏反应（抗体介导）

II型：IgG/IgM介导的细胞毒性（如溶血、血小板减少）；

III型：免疫复合物沉积引发补体激活→组织损伤（如血管炎、肾小球肾炎）；

相关病理表现：血管炎、肾小球肾炎、贫血、血小板减少

潜在早期信号：循环免疫复合物升高、IgM水平上升

调查策略：权重证据法（Weight-of-Evidence）

需整合以下信息：血浆/血清中药物浓度与抗药抗体（ADA）水平；出现药物反应动物的组织病理学结果；血液学指标：红细胞数量/形态、血小板计数；补体成分水平（但死亡方式可能影响检测）；免疫组化：显示药物、IgG、IgM、补体在组织中的颗粒状沉积。

3.IV型超敏反应（迟发型，T细胞介导）

特点：延迟发生（通常24–72小时）；

适用场景：局部用药（如外用制剂）需评估致敏性；

检测方法：LLNA也逐渐被接受用于评估IV型反应的致敏潜力（除I型外）。

六、免疫原性（Immunogenicity）

分子量>1000道尔顿的物质可能具有免疫原性。

引发两类主要风险：1）药效学改变与疗效丧失：因药物与体内产生的ADA结合，导致中和或清除；2）致敏性/过敏反应（Allergenicity）。

ADA检测是判断免疫原性的核心手段。

七、自身免疫性（Autoimmunity）

1.药物相关自身免疫的机制

多见于小分子药物（<1000Da）；

通常通过形成半抗原（hapten）与自身蛋白结合，触发异常免疫应答；

常伴有遗传易感性，例如人类中的HLA-DR3等位基因。

2.非临床研究的局限性

自身免疫疾病机制复杂；目前尚无公认的非临床测试方法可可靠预测药物诱发的自身免疫。

3.常见临床表现

药物诱导的自身免疫常表现为血液系统异常，包括：中性粒细胞减少症（neutropenia）、血小板减少症（thrombocytopenia）、贫血（anemia）

4.生物药的特殊风险

治疗性生物制品（如单抗、细胞因子）可引起意外的血液学异常；

其中部分为免疫介导，且无法通过常规非临床研究预测；

但也有成功预测的案例：1）噬血现象（hemophagocytosis）：见于重组细胞因子/生长因子；2）血小板减少症：见于抗-CD40L单克隆抗体。

神经系统毒性生物标志物

中枢神经系统（CNS）由功能高度特化的神经元胞体（核团）组成。血脑屏障（BBB）通常可阻止外源物质（xenobiotics）进入。但某些药物因设计或理化性质（如脂溶性高）可穿过BBB，带来神经毒性风险。目前尚无经验证、常规使用的分子/化学类CNS毒性生物标志物。

当前评估方法为功能性观察组合（Functional Observation Battery, FOB），用于评估神经行为功能，包括：运动协调、自主活动、行为改变、感觉/运动反射、体温调节。

组织病理学检查也是手段之一，包括对脑和脊髓在标准非临床安全性研究中常规进行组织学评估。当前神经毒性评价高度依赖形态学（如神经元变性、坏死）。

未来发展方向：提升敏感性与机制解析

（1）脑脊液（CSF）

可反映CNS损伤的多种变化：CSF颜色、量的改变；单核细胞数量与成分变化；生化指标异常。

神经递质及其代谢物变化可提示毒性：多巴胺、谷氨酸、GABA、肾上腺素、5-羟色胺；代谢物如高香草酸（HVA）、5-羟吲哚乙酸（5-HIAA）；例：伊维菌素中毒的柯利犬，CSF中HVA升高。

其他潜在CSF标志物：总蛋白、白蛋白（反映BBB通透性）；C反应蛋白（CRP）；髓鞘碱性蛋白（MBP）；S-100蛋白（胶质细胞损伤标志）。

随着代谢组学与质谱技术进步，CSF分析有望成为CNS安全性评估的重要辅助工具。

（2）分子影像技术

MRI、PET、SPECT已用于药物研发：PET示踪剂靶向TSPO（如TP-18）→检测小胶质细胞活化（神经炎症）；评估BBB上黏附分子（CD62E）和P-糖蛋白（CD243）的表达与完整性；利用[¹⁸F]FDG（氟代脱氧葡萄糖）评估CNS葡萄糖代谢。

随着技术成本下降、分辨率提升，影像学将提供更全面、特异的CNS安全性评估手段。

4.周围神经系统毒性：背根神经节（DRG）

AAV基因疗法在非临床研究中偶见DRG毒性（虽属外周，但功能上与CNS紧密关联）；

神经丝轻链（Neurofilament Light Chain, NF-L）被确认为非侵入性DRG毒性生物标志物：NF-L是神经元细胞骨架蛋白，神经损伤时释放入体液。

在Wistar Han大鼠和食蟹猴中血浆/血清NF-L在给药后第8–14天显著升高。与神经元变性/坏死、神经纤维退化高度相关。相比之下，CSF中NF-L升高与组织损伤相关性较弱。

意义：血清NF-L可作为纵向、非终点、可转化至临床的神经毒性监测指标。

生殖系统毒性生物标志物

1.系统复杂性

生殖系统受下丘脑-垂体-性腺轴精密调控：

中枢：LH（黄体生成素）、FSH（卵泡刺激素）；

外周：雌激素、孕酮、睾酮等性激素；

标准生殖毒性研究（如ICH S5）成本高、周期长，通常在开发后期进行。

2.理想目标

开发可在28天重复给药毒性试验中检测的非侵入性生物标志物；

用于早期预警生殖毒性，并帮助解释短期研究中观察到的组织学变化。

3.现有激素指标的局限性

常用激素：雌激素、孕酮、泌乳素、睾酮、LH、FSH；

问题：易受应激、昼夜节律、动情周期/月经周期干扰；在大型毒理研究中变异大、解读困难。

4.雌性动物评估

动情周期监测可反映生殖健康；但在周期较长的物种（如犬）中实用性低；更适合短周期物种（如大鼠）。

5.雄性生殖毒性评估

当前金标准：睾丸及附属性器官的组织病理学；器官重量变化。

新兴生物标志物——抑制素B（InhibinB）。由支持细胞（Sertolicells）分泌，受雄激素刺激；负反馈调节FSH，参与精子发生调控；

临床意义：不育男性血清抑制素B水平显著低于可育男性；

优势：可通过非终点、纵向采样（血清）监测；具有种属间可转化性（从动物到人）；行业正积极推动其在非临床与临床试验中的验证与应用。

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