PNAS | 邱建明团队揭示TBC1D23-AAVR互作驱动AAV细胞内逆向运输的关键机制

腺相关病毒（ adeno-associated virus ， AAV ）是一类无包膜小型细小病毒。重组 AAV （ rAAV ）具有安全性较好、可转导分裂和非分裂细胞以及转基因表达持久等优势，已成为基因治疗领域最重要的递送平台之一。 然而，许多应用仍依赖较高的载体剂量，既增加生产负担，也可能提高针对衣壳或载体基因组的免疫反应风险。因此，阐明 AAV 从细胞表面进入、穿越 胞 内膜性区室并到达细胞核的完整路径，是进一步提高转导效率和安全性的关键。

AAV 进入细胞通常经历两步受体识别：首先结合细胞表面糖链，随后与蛋白受体 AAVR （又称 KIAA0319L ）结合。 AAVR 胞外的五个 PKD 可直接识别不同血清型的 AAV 衣壳，但其短小的胞质 C 端尾部如何连接胞内运输机器，此前一直不清楚。已有研究提示， AAV 需要沿内体到反式高尔基网络（ trans-Golgi network ， TGN ）的逆向运输路径移动；然而，负责把 AAVR 携带的病毒囊泡递送至 TGN 的宿主衔接因子仍未被鉴定。

近日，美国堪萨斯大学医学中心（ University of Kansas Medical Center ）邱建明团队联合阿拉巴马大学伯明翰分校颜子颖团队在PNAS发表题为TBC1D23-AAVR interaction drives endosome-to-TGN trafficking required forrAAVtransduction的研究论文 。 该研究鉴定出 TBC1D23 是连接 AAVR 与 TGN 的关键胞内运输衔接蛋白，并揭示 AAVR 胞质尾部的酸性残基簇是招募 TBC1D23 、推动 AAV 从内体到 TGN 逆向运输的核心信号。 研究表明， TBC1D23 与 AAVR 胞质 C 端可直接 以纳摩尔亲和力结合；敲除 TBC1D23 会显著降低多种 AAVR- 依赖的 AAV 血清型在多种人源细胞以及 人气道 上皮中的转导，并阻断 AAV 衣壳在 TGN 的汇聚。破坏 AAVR 的酸性 残基簇会完全 消除 TBC1D23 结合，使 AAV 无法有效到达 TGN 和细胞核，但并不影响病毒内 吞 。该工作由此确定了一个位于 病毒 受体 C 端、决定 AAV 能否完成有效转导的胞内运输 关键决定 点。

首先，研究人员确认 AAVR 参与 AAV 的早期进入过程。 在野生型 HEK293 细胞中， AAV5 衣壳可在 转导早期与细胞表面的 AAVR 共同定位，并随后出现在 STX5 内吞囊 泡 和 TGN46 阳性 反式 高尔基体网络（ TGN ） 区室。相比之下， AAVR 敲除使 2 小时内化的 AAV5 载体基因组减少约 98% ，提示 AAVR 既参与病毒进入，也为后续胞内运输提供起点。

随后，研究团队以 AAVR 胞质 C 端为 “ 诱饵 ” 寻找运输衔接蛋白。 通过 GST-AAVR-C 亲和纯化和定量质谱，研究人员鉴定出 TBC1D23 、 COPG1 、 ASAP1 和 COPS3 等候选蛋白。功能筛选显示， TBC1D23 是其中对 AAV 转导影响最显著的因子：在 HEK293 细胞中， TBC1D23 敲除使 rAAV2.5T 阳性细胞减少约 95% ，荧光素酶活性下降 73% ；在 HeLa 和 Huh7 细胞中，转导也下降 72.4%-80.7% 。此外， rAAV2 、 rAAV5 和 rAAV8 在不同细胞中的转导下降 55.6%-80.2% 。

更重要的是，在气液界面培养的极化 人气道 上皮（ HAE-ALI ）中，敲除 TBC1D23 同样显著降低 rAAV2.5T 的长期报告基因表达。该模型可重建人近端气道的假复层结构，因此这一结果提示 TBC1D23 不仅在常规细胞系中发挥作用，也与面向囊性纤维化等肺部疾病的 AAV 基因递送密切相关。

接下来，研究人员证明 TBC1D23 与 AAVR 之间存在直接、选择性的蛋白互作。 体外 GST 拉下 (pulldown) 显示， AAVR 胞质 C 端可直接 结合 TBC1D23 的 C 端 PH 样支架结构域。生物层干涉技术（ BLI ）进一步测得平衡解离常数 KD 为 44.2 nM ，而 GST 对照没有可检测结合。这一结果排除了必须依赖大型高尔基复合物间接连接的可能，确立了 AAVR-TBC1D23 之间的受体 - 衔接蛋白关系。

AAVR 胞质尾部究竟通过什么信号招募 TBC1D23 ？ 研究人员比较了 AAVR-C 中多个潜在分选基序，并利用 AlphaFold 3 对 AAVR-C 与 TBC1D23-C 复合物进行结构预测。模型提示， AAVR-C 中央的酸性残基簇（ acidic residue cluster ， ARC ）与 TBC1D23-C 表面的碱性残基形成互补界面，其中 D1010 和 D1011 可能位于关键接触区域。

为验证这一预测，团队构建了 ARC 突变体 AAVR- mARC ，并以 C 端双亮氨酸 基序突变体 AAVR- mLL 作为对照。 BLI 结果显示， ARC 突变完全消除了 AAVR-C 与 TBC1D23-C 的结合；相反， mLL 突变仍 保持稳定结合， KD 约为 59.7 nM 。由此可见， ARC 并非一般性的尾部序列，而是 TBC1D23 识别 AAVR 的主要运输信号。

进一步的互补实验把蛋白结合与病毒运输功能联系起来。 研究人员在 AAVR 敲除细胞中分别稳定表达 AAVR-WT 、 AAVR- mARC 或 AAVR- mLL 。 AAVR-WT 与 mLL 均可恢复 rAAV2.5T 转导和衣壳在 TGN46 阳性区室中的富集，而 mARC 无法恢复，表型与 AAVR 缺失近似。 mARC 细胞中的 AAV 衣 壳主要 停留在外周点状区室，衣壳与 TGN46 的重叠显著下降。

值得注意的是， ARC 突变并未降低 rAAV2.5T 、 rAAV5 或 rAAV8 的病毒内化，却显著减少载体基因组进入细胞核。对于 rAAV5 和 rAAV8 ， mARC 使转导下降 98%-99% ，而 mLL 不产生类似影响。这将 TBC1D23-AAVR 互作的作用位置精确限定在 “ 内 吞 之后、入核之前 ” ，说明其主要控制 AAV 从 内吞囊 泡 通向 TGN 的逆向运输，而不是细胞表面结合 或内吞本身 。

最后，研究团队通过共聚焦成像和内体免疫沉淀重建了 AAV 的运输路线。 在对照细胞中，进入细胞的 AAV5 衣壳在核 周区域 与 AAVR 和 TGN46 共同富集； TBC1D23 缺失后，衣壳滞留在细胞外周，与 TGN46 或 GM130 的共同定位明显下降，而 AAVR 总蛋白水平没有变化。这说明 TBC1D23 主要调节 AAVR 的亚细胞定位和 囊泡 递送，而不是 AAVR 的稳定性。

内体免疫沉淀显示， AAVR 相关囊泡中可检测到 AAV 衣壳、 TGN46 和 STX5 ，但检测不到早期内体标志 Rab5 ； TBC1D23 相关囊泡中则可检测到 AAV 衣壳、 AAVR 和 TGN46 ，而 STX5 和 Rab5 阴性。这些结果支持一个分步模型： AAV-AAVR 复合物经 CLIC/GEEC 相关 内吞途径 进入 STX5 阳性 内 吞 囊 泡 ，随后 AAVR 胞质尾部的 ARC 招募 TBC1D23 。 TBC1D23 进一步连接 WDR11-FAM91A1 复合物以及 TGN 上的 golgin-97/245 ，从而捕获、系留并停靠携带 AAV 的囊泡，使其在 TGN 汇聚。

图 . TBC1D23 连接 AAVR 与 WDR11-FAM91A1/ golgin 系留机器，促进 AAV-AAVR 复合物由 内吞囊泡 向 TGN 运输。

综上，这项研究将 AAVR 的功能从 “ 衣壳结合与进入受体 ” 拓展为 “ 胞内货物分选受体 ” ： AAVR 不仅在细胞表面识别 AAV ，其胞质尾部还通过 TBC1D23 主动接入逆向运输机器。 TBC1D23 因此构成一个受体近端的关键运输检查点，决定内化的 AAV 能否从内体到达 TGN 、进一步进入细胞核并产生有效转导。这一发现 补充 了 AAV 进入路径中的一个重要缺口，也为载体优化提供了新的宿主 - 病毒界面。未来可通过解析 AAVR-TBC1D23 复合物结构、寻找增强该界面的药理或工程化策略，促进逆向运输并在保持疗效的同时降低载体剂量。

堪萨斯大学医学中心 Xiujuan Zhang （张秀娟）博士为论文第一作者， Jianming Qiu （邱建明）教授为通讯作者。阿拉巴马大学伯明翰分校 Ziying Yan （ 颜子颖 ）教授参与研究设计与论文撰写。

原文链接：https://doi.org/10.1073/pnas.2605086123

Qiu Lab 现有博士后研究员岗位开放，研究方向包括 AAV 基因递送 生物学、 呼吸道 基因递送与基因治疗。申请者应具有生命科学相关博士学位和具有分子生物学及同行评议论文发表经验者优先。申请材料包括个人简历（ CV ）和求职信。

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制版人：十一

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