北京大学，重磅Nature！

基于“点击化学”的结合-释放策略：突破内吞屏障的靶向抗癌药物递送

长期以来，抗体药物偶联物（ADC）和小分子药物偶联物（SMDC）等靶向抗癌药物依赖受体介导的内吞作用来实现药物释放，然而人体超过2000种膜蛋白中仅有约180种能够高效内吞，这极大限制了可靶向的抗原范围。即便对可内吞的靶点，药物需经历溶酶体运输等多步过程，最终仅有少量偶联物成功释放 payload。这种“内吞-释放”模式面临着靶点匮乏与递送效率低下的双重瓶颈。成纤维细胞活化蛋白（FAP）作为在28种癌症中癌症相关成纤维细胞高表达、正常组织几乎不表达的泛癌抗原，其靶向潜力惊人，FAP靶向放射性药物已在临床诊断中取得成功。然而，由于FAP内吞效率低下，FAP靶向药物偶联物的临床疗效极为有限——临床候选药物OMTX705在患者中最佳响应仅为26%的疾病稳定。这一困境突显了亟需一种能够绕过内吞机制的药物释放新模式。

针对这一长期存在的挑战，北京大学刘志博教授团队提出了一种全新的“结合-释放”策略，实现了独立于内吞作用的靶向药物递送。该策略的核心是设计出一种在血液循环中保持稳定、但在配体-受体结合时，由靶点结合口袋内亲核残基直接切割连接子、释放膜通透性细胞毒性药物的化学体系（图1a）。研究者开发了磷(V)-酚交换（PhoPEx）化学，并基于此构建了BTR平台。在FAP靶向的SMDC中，BTR策略使肿瘤中MMAE的暴露量（AUC0-120h）达到内吞依赖型FAP-ITR-SMDC的5.9倍，与FAP-ITR-ADC水平相当，同时显著降低了非靶组织释放。这使肿瘤-血液比分别达到FAP-ITR-SMDC和FAP-ITR-ADC的14.7倍和3.6倍，肿瘤-肝脏比则达到55.1倍和58.7倍。该优异的生物分布显著提高了最大耐受剂量，并在多种肿瘤模型中实现了近乎完全的肿瘤消退。研究者还将BTR扩展至PD-L1靶点和mRNA展示来源的FAP环肽，显示出广泛的适用性。该工作为突破内吞屏障、拓宽治疗与诊断偶联物的靶点范围建立了全新框架。相关论文以“A binding-to-release strategy for targeted anticancer drug delivery”为题，发表在Nature上。

为实现这一概念，研究者开发了PhoPEx化学。受硫(VI)氟交换（SuFEx）点击化学启发，研究团队将中心亲电原子从硫替换为磷，开发了PhoPEx反应（图1c），显著提升了与酪氨酸类似物的反应速率。基于分子对接预测——FAP结合口袋内亲核残基与FAPI配体相邻（图1d）——研究者将含p-羟基苄醇离去基的第一代PhoPEx连接子与FAPI偶联。体外实验表明，PhoPEx-BTR偶联物在FAP蛋白存在下24小时内实现了FAP依赖性荧光报告分子释放，而SuPEx偶联物和PBS对照组无响应（图1e，1f）。细胞层面，HT1080-FAP细胞在24小时后呈现显著荧光激活，而HT1080对照细胞信号极弱（图1g）。

为验证BTR是否真正绕过内吞，研究者比较了携带膜通透性MMAE与相对不通透MMAF的偶联物。尽管内吞依赖型Val-Cit连接子在HT1080-FAP细胞中无论MMAE还是MMAF均能介导细胞杀伤，PhoPEx-BTR偶联物仅在MMAE中诱导强效细胞毒性，MMAF偶联物无效（图1h）。这明确表明BTR平台通过胞外、非内吞释放机制发挥作用。尾静脉注射MMAE负载的BTR偶联物在HT1080-FAP异种移植瘤中实现了强效且特异的肿瘤生长抑制，而在FAP阴性的HT1080肿瘤中几乎无效（图1i-1k）。然而第一代PhoPEx连接子的反应效率仍不足以匹配小分子药物的短循环半衰期，需进一步发展更高反应活性的PhoPEx连接子。

图1 | PhoPEx化学使BTR策略实现独立于内吞的靶向药物释放。

基于此，研究者对PhoPEx骨架进行了系统结构优化（图2a）。在苯环不同位置引入系列给电子和吸电子基团，合成了15种PhoPEx结构，并与酪氨酸类似物反应测定反应速率常数（kreact），在pH 9.5缓冲液中测定水解速率常数（khydro）。以SuFEx为基准，部分PhoPEx结构落在“高反应性、高稳定性”区域，其中对位酰胺和间位氟取代表现最优（图2b，2c）。间位氟取代的优化连接子（化合物2）将反应半衰期缩短至3.5小时，更好地匹配小分子药物动力学，同时基本保留了水解稳定性（图2f）。PET-CT成像显示，PhoPEx-FAPI-mF在肿瘤中的SUVmax和SUVmean均较未取代版本提升约两倍，表明在活体内反应效率显著增强（图2d，2e）。

为明确FAP蛋白上Payload释放的反应机制——特别是排除FAP自身水解酶活性的可能性——研究者采用串联质谱（MS/MS）、定点突变和冷冻电镜（cryo-EM）鉴定了关键亲核残基（图2g）。串联质谱分析表明，Tyr745是PhoPEx-FAPI-pCONH与FAP蛋白孵育后的主要反应位点（图2h），次要位点位于同一α螺旋的相邻残基（如His743和Thr741）。将Tyr745突变为苯丙氨酸后，共价结合效率显著降低（图2i），payload释放速率较野生型FAP下降63%（图2j）。冷冻电镜结构进一步解析了结合模式——FAPI靶向头与FAP结合，反应性磷中心在空间上与Tyr745相邻，与前述实验结果一致（图2k，2l）。这些数据确证了BTR通过靶点结合口袋内Tyr745残基的邻近诱导亲核进攻实现特异性释放。

图2 | 通过Tyr745邻近诱导的PhoPEx释放。

在临床样本中验证BTR策略的有效性后，研究者进一步评估BTR能否满足控释系统的关键参数——特异性和效率，并与经典内吞-释放模式（Val-Cit连接子）进行比较（图3a）。在分子层面，FAP-BTR-SMDC（化合物5）对FAP蛋白表现出高度结合选择性，对同源蛋白的选择性超过1000倍（图3b）。即使在100倍当量亲核氨基酸、10倍当量其他蛋白或人血清存在下，从荧光分子到MMAE和exatecan等细胞毒性药物的payload释放仅在添加FAP蛋白时快速、特异性地发生（图3c，3d）。相比之下，传统FAP激活型底物Gly-Pro二肽可被DPPIV、PREP等同源蛋白酶及CTSB等水解酶非特异性切割。细胞层面，化合物5对FAP阳性细胞的IC₅₀为9.0 nM，而对照细胞为498.9 nM（图3e）。与内吞依赖型Val-Cit连接子相比，BTR-PhoPEx连接子在相同时间点释放的荧光信号高出8倍以上（图3f，3g）。

在动物模型中，静脉注射1.0 mg/kg化合物5后，HT1080-FAP肿瘤中MMAE浓度在24小时时较HT1080肿瘤高34.5倍（图3i），BTR-SMDC在肿瘤中的MMAE暴露量（AUC0-120h）是ITR-SMDC的5.9倍，与ITR-ADC相当（图3m）。SPECT-CT成像显示BTR-SMDC在肝脏有额外摄取（图3h）。在血液和肝脏中，BTR-SMDC的非靶组织释放均更低，肿瘤-血液比达到39.7，肿瘤-肝脏比达到358.1，分别是ITR-SMDC的14.7倍和55.1倍、ITR-ADC的3.6倍和58.7倍（图3j-3l，3n）。这些结果表明，在FAP靶点上，PhoPEx连接子通过BTR机制相较于内吞依赖型Val-Cit连接子展现了更优的释放特异性和效率。

图3 | BTR策略展现释放特异性以实现高效药物递送。

基于上述释放特异性和效率优势，研究者测试了BTR是否能够拓宽治疗窗口。在急性毒性研究中，FAP-BTR-SMDC的最大耐受剂量（MTD）以摩尔剂量计是FAP-ITR-SMDC的7.5倍（图4a）。在CDX疗效研究中（图4b），单次静脉注射6.2 mg/kg的FAP-BTR-SMDC在30天内使100%的小鼠（8/8）达到完全缓解，体重稳定，生存率100%（图4c-4f）。在PDX模型中（图4g），肉瘤PDX中BTR-SMDC（图4h-4j）疗效优于ITR-SMDC，略优于ITR-ADC；在胰腺腺鳞癌PDX——一种以密集纤维化间质限制大分子穿透为特征的临床难治性肿瘤——BTR-SMDC疗效显著优于ITR-ADC（图4k-4m）。BTR-SMDC在MC38-FAP CDX、下咽癌PDX和十二指肠乳头周围癌PDX模型中也表现出抗肿瘤活性，疗效与FAP表达水平相关。综合毒性和疗效数据表明，BTR平台拓宽了治疗窗口。

图4 | BTR药物递送系统在FAP靶向的CDX和PDX模型中展现改善的治疗效果。

研究者还将BTR策略扩展至其他靶点。mRNA展示技术能够构建超大型库并支持直接体外筛选（图5a）。鉴于PhoPEx与SuFEx化学的机制相似性，研究者将含SuFEx的环肽中非天然氨基酸直接替换为含PhoPEx释放结构的非天然氨基酸（图5b）。实验表明，当连接子含四个碳原子时，payload释放速率达到最大（速率常数3.25 h⁻¹），荧光分子可在1小时内完全释放（图5c，5d），初步证明了基于mRNA展示筛选PhoPEx肽-药物偶联物的可行性。

此外，研究者对PDBbind数据库中19,037个配体-蛋白共晶结构进行生物信息学分析，发现94.4%的结构在配体10 Å范围内至少含一个酪氨酸残基。基于PD-L1的临床重要性和低内吞效率，研究者将其选为第二个靶点。根据已报道的环肽配体结构（图5e），分别在甘氨酸或亮氨酸位置引入PhoPEx——甘氨酸替换使结合亲和力显著降低，而亮氨酸替换保持高亲和力（8.4±2.2 nM）（图5f）。高亲和力变体在体外实现了PhoPEx介导的香豆素、MeRho和MMAE的释放（图5g-5i）。在HT1080荷瘤小鼠体内，PD-L1-BTR-SMDC展现了比PD-L1-ITR-SMDC更特异的肿瘤MMAE释放，且可被BMS-986189阻断（图5j）。PD-L1-BTR-SMDC在胃腺癌PDX模型中展现了更优的抗肿瘤疗效（图5k-5m）。这些发现表明BTR策略有望扩展至其他重要治疗靶点，展示出广泛的应用潜力。

图5 | 将BTR系统扩展至其他临床重要靶点。

总结与展望

本研究首先开发了PhoPEx化学，优化了其反应性和稳定性，并初步阐明了反应机制——Tyr745是FAP上邻近诱导反应的关键亲核残基。基于PhoPEx化学构建的BTR策略将药物释放从内吞中解耦，在FAP这一低内吞效率靶点上展现出优异的释放特异性和效率，实现了5.9倍于ITR-SMDC的肿瘤payload暴露量，肿瘤-背景比提升最高达58.7倍，MTD提升7.5倍，并在多种模型中达到近乎完全的肿瘤消退。BTR策略旨在作为传统内吞-释放路径的补充——后者对HER2、TROP2等高内吞靶点高度有效，但面对绝大多数低内吞膜蛋白存在固有局限。与依赖肿瘤微环境蛋白酶或外源触发剂的胞外释放方案不同，BTR平台采用单药剂、直接由靶标结合诱导的邻近化学反应，不依赖酶活性或外源共给药。胞外释放膜通透性payload可能带来更优的肿瘤微环境分布和旁观者杀伤效应，同时脱靶毒性风险因肿瘤中释放的payload仅占给药总量的极小部分而可控。展望未来，PhoPEx-BTR平台通过直接结合诱导机制超越了传统方法的细胞摄取局限，为靶向内吞-释放策略难以有效处理的抗原提供了互补框架，有望显著拓展偶联药物疗法的靶点范围。