散斑血流成像专题（25）丨激光散斑成像监测鸡胚尿囊膜微血管

鸡胚尿囊膜(chorioallantoic membrane，CAM)模型关注的对象是鸡胚的尿囊膜，它是胚胎外的一层薄膜，胚胎通过其表面大量的血管网进行气体交换及营养摄取，其透明的特性，使得无损伤地观察个别血管以及测量在接受各种不同的治疗以后血管结构的变化成为可能。因此CAM是一种理想的研究PDT诱导血管损伤、肿瘤生长以及新生血管生成的活体动物模型，所以选用该模型进行活体水平实验.同时利用稳定高表达绿色荧光蛋白(green fluoresce nceprotein，GFP)的肿瘤细胞，采用荧光成像方法就可以对肿瘤组织进行精确定位并观察其生长。

PDT实验需要持续使用激光照射，导致以往研究主要关注PDT治疗前后血管管径的变化，仅对血管进行明场成像，忽略了PDT过程中血液流速以及灌流量等细节问题。本实验应用激光散斑成像技术实时监测血管的变化，通过对红细胞后向散射散斑的一阶和二阶统计分析获取血流信息，使用衬比成像技术，无需扫描装置即可对感兴趣区域内的血流实时高分辨率成像。使用高数值孔径物镜和快速的电子耦合器件(CCD)，激光散斑衬比成像就可以高时空分辨地监测血液的流速分布、灌注率等血液动力学变化，故非常适用于研究PDT对血管的破坏作用。

鸡胚尿囊膜肿瘤模型的制备

将种蛋用0.01%的新洁尔灭水溶液清洗，水温35℃左右.晾干后将鸡蛋气室向上，长轴与蛋托成45°放入37.8℃恒温培养箱。培养箱中放入一只装有1L蒸馏水的烧杯以保持湿度(湿度50%~60%)，每隔12h翻蛋1次.孵育72h后，取出种蛋，用75%乙醇擦拭蛋壳。用直接敲壳法将鸡胚移入自制的孵育容器内进行鸡胚无壳培养。在第9~11天将50μl含4.0×106~7.0×106个ACC-M-GFP细胞的悬液接种至鸡胚CAM上，24h后在荧光体式显微镜下选出汞灯照明下可见绿色荧光的鸡胚，用CCD对其成像。隔24h后再次观察该肿瘤，并与第一次的图像进行对比，如发现绿色荧光部分增大，表明该鸡胚上有实体瘤生长.将已有实体瘤生长的鸡胚分为实验组和对照组进行实验。

鸡胚生长胚龄解剖图

活体水平的PDT实验

实验组：在鸡胚尿囊膜上的肿瘤处放置一直径为1cm的塑料圆环，圆环内包含部分ACC-M-GFP肿瘤及周围血管，并在圆环内加入不同浓度的光敏剂Pyro-acid溶液(终浓度分别为20!mol/L，30!mol/L，40!mol/L)100!l.将实验组鸡胚置于恒温培养箱内孵育0.5h后，用无菌PBS液冲洗2次，拿掉塑料环，使用温控半导体光纤耦合激光器(!=(656.2±1.4)nm，Maxoutput=300mW)对原圆环区域内的CAM进行照射，激光输出功率分别为20mW/cm2、40mW/cm2，照射时间分别为15min和30min，则总输出功率分别为18J/cm2、36J/cm2、72J/cm2。照射过程中利用激光散斑成像技术，实时监测鸡胚尿囊膜(CAM)上给药区域血管变化，并每隔5min对尿囊膜上的照射区域进行明场成像.照射后继续培养24h，再次对相同区域血管进行激光散斑成像。

对照组：对照组分为光照对照组和光敏剂对照组.光照对照组不需加任何光敏剂，直接使用与实验组中参数相同的激光照射CAM上的肿瘤及其周围血管区域；光敏剂对照组则使用与实验组中浓度相同的光敏剂Pyro-acid溶液处理CAM的肿瘤区域，但不使用激光照射。

光学成像系统

荧光成像时，由荧光变焦体式显微镜(Leica MZFLⅢ)所带的CCD(分辨率为6.45!m/pixel)采集鸡胚上的肿瘤以及光敏剂浸润区域由汞灯激发出来的荧光信号，用以定位肿瘤以及确定激光照射区域.所用滤光片分别为GFP专用滤光片组(Ex=470/40nm，Em=525/50nm)和Pyro-acid专用滤光片组(Ex=425/60nm，Em=590nmLP)。

激光散斑成像时，基于激光散斑成像原理，系统包括光路和成像系统.散斑的形成需要高相干性的光源，因此光路采用实验中用于PDT激光照射的温控半导体光纤耦合激光器，避免了PDT激光照射和散斑成像光源的切换和互相干扰，也减少了系统开销。激光器发出的光束耦合到光纤(直径为0.2mm)，光纤的一端耦合微透镜，光束直接照射在含有高散射物质的生物样品表面，光斑面积约为1cm2。成像系统部分利用上文提到的荧光成像部分，样品中的后向散射光信号被带有CCD的荧光变焦体式显微镜收集，通过图像采集卡与计算机相连接，并由计算机处理图像信号。根据血管大小和流速来设定图像采集控制软件的图像象素大小、图像帧数和曝光时间等参数。增加辅助物镜和使用高倍物镜即可进行高空间分辨成像，CCD最快成像速度为80帧每秒，可观察快信号的变化。

实验数据分析：

由CCD得到血流分布的原始散斑图像，计算散斑图像的衬比。根据散斑衬比与组织中的散射物质运动速度的反比例关系，计算出血流速度分布和血管灌注率。血管管径变化可根据血流速度分布图像中血管与背景的强烈对比关系测量得到。

CAM肿瘤模型的荧光成像

将经过荧光基因转染的肿瘤细胞接种于CAM上，肿瘤实体经一定波长的光照射以后发出荧光，本文的肿瘤制备方法是在鸡胚尿囊膜上滴加细胞悬液，由于鸡胚自身的翻动，使肿瘤在整个鸡胚尿囊膜上散在分布生长，肉眼可见一些白色散在的小点样团块。为了准确地确定肿瘤的位置，作者应用荧光成像技术确定肿瘤的生长区域，定位PDT实验中的肿瘤周围血管。实验中发现肿瘤生长范围(图2中白色区域)清晰可见。较好地解决了以往的鸡胚肿瘤模型无法对肿瘤精确定位的问题，为有效地监测肿瘤及其周围新生血管的生长提供了一个极好的途径。

参考文献：

• 周斯博,张智红,刘谦,等.光学成像技术在体研究肿瘤的光动力效应[J].生物化学与生物物理进展,2005(10):969-974.

• 周斯博. 基于鸡胚尿囊膜肿瘤模型的PDT效应研究[D].华中科技大学,2006.

• Biotechnological applications of green fluorescent protein[J]. J. C. March;;G. Rao;;W. E. Bentley.Applied Microbiology and Biotechnology,2003(4)

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