组织来源细胞外囊泡非侵入性诊断肾细胞癌亚型：从标志物发现到单细胞溯源

*仅供医学专业人士阅读参考

不同病理亚型肾细胞癌的组织来源EV转录组特征可通过尿液EV实现无创检测，为肾癌精准分型和术后监测提供了全新策略。

肾细胞癌（RCC）是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，其发病率逐年上升，且死亡率居泌尿生殖系统肿瘤之首。RCC主要分为三种病理亚型：透明细胞型（ccRCC，约占70%-80%）、乳头状型（pRCC，约占10%-15%）和嫌色细胞型（chRCC，约占5%-10%）。其中ccRCC又根据Fuhrman分级分为低级别（I-II级）和高级别（III-IV级），二者在预后和治疗反应上差异显著。对于晚期或不适合手术的患者，术前常需依赖有创肾穿刺活检来明确亚型以指导用药，这既增加了患者痛苦，也面临取样误差和并发症风险。因此，临床上迫切需求一种能无创区分RCC亚型、特别是ccRCC高/低级别的生物标志物。

一篇发表于Journal of Extracellular Vesicles的研究[1]，系统分析了25例RCC患者的配对肿瘤/正常组织及其组织来源细胞外囊泡（Ti-EV），结合机器学习、单细胞测序和大量尿液样本验证，成功鉴定出各亚型特异性的RNA标志物，并证实这些标志物可经尿液细胞外囊泡实现无创检测。本文对该研究的核心发现进行提炼与解读，以飨读者。

从组织到Ti-EV：挖掘亚型特异性的RNA指纹

研究团队首先收集了pRCC、chRCC、低级别ccRCC、高级别ccRCC以及良性血管平滑肌脂肪瘤（AML）各5例的配对肿瘤和正常组织，并从中提取Ti-EV。通过透射电镜、纳米流式和蛋白印迹确认了EV的典型形态、粒径分布和标志物表达（CD63、CD9、Flotillin-1阳性，GM130阴性）。值得注意的是，肿瘤来源的Ti-EV浓度显著高于正常组织，提示肿瘤微环境中EV分泌活跃。

随后，研究者对组织和Ti-EV中的长链RNA进行测序，并筛选出在二者中共同差异表达的基因。结果显示，不同亚型Ti-EV与其来源组织间的转录组相关性存在差异：chRCC及高级别ccRCC的相关性较高，而pRCC及低级别ccRCC的相关性相对较弱，提示不同亚型肿瘤细胞在EV形成过程中可能存在差异性的分选机制。

利用神经网络（Nnet）模型，研究者从这些共同差异基因中筛选出每个亚型最具影响力的前10个mRNA和lncRNA。关键发现包括：

pRCC：MMP15和HCN2 mRNA，以及NEAT1、AL138826.1等lncRNA；

chRCC：DSG2 mRNA以及AC073283.2、LINC02535等lncRNA；

低级别ccRCC：SERPINA1、VEGFA、CPE、EGLN3、NDUFA4L2等mRNA，以及C6orf223等lncRNA；

高级别ccRCC：TGFBI、APOC1、DEFB1、NDUFA4L2等mRNA，以及LINC00887、LINC01187等lncRNA。

尤其值得关注的是，NDUFA4L2在低级别和高级别ccRCC中均显著上调，而VEGFA仅富集于低级别ccRCC，APOC1和TGFBI则特异性富集于高级别ccRCC。这些结果首次揭示了Ti-EV携带的RNA可高度特异地反映其来源组织的病理亚型，为后续无创检测奠定了分子基础。

从Ti-EV到尿液EV：无创诊断的临床转化验证

为了验证组织中发现的Ti-EV标志物能否在尿液中被检测到，研究者构建了包含178例术前及术后尿液样本的前瞻性验证队列，分别提取尿液EV（uEV）和上清液，采用定量PCR和微滴式数字PCR（ddPCR）检测标志物水平。

结果显示，在ccRCC中，低级别ccRCC的三个标志物（NDUFA4L2、VEGFA、SERPINA1）在uEV中的含量显著高于其他亚型及良性病变，且联合诊断的曲线下面积（AUC）达到0.922（95% CI: 0.873～0.971）；高级别ccRCC的三个标志物（NDUFA4L2、APOC1、TGFBI）联合诊断的AUC为0.874（95% CI: 0.775～0.974）。这些标志物在uEV中的丰度远高于尿液上清液，证实其确实以EV形式存在而非游离RNA。

更为关键的是，术后1-3个月复查时，这些uEV标志物水平显著下降，表明它们主要来源于手术切除的原发肿瘤，而非其他组织。这一“手术前后动态变化”的证据强有力地支持了uEV标志物用于术后残留病灶监测的潜力。此外，森林图分析显示，这些标志物与ccRCC诊断的比值比（OR）均具有显著统计学意义，进一步强化了其临床相关性。

单细胞测序溯源与肿瘤相关巨噬细胞Ti-EV的驱动作用

Ti-EV来自肿瘤微环境中的多种细胞，为精准追溯Ti-EV的细胞起源，研究者对14例RCC样本（5例pRCC、3例chRCC、3例低级别ccRCC及3例高级别ccRCC）进行了单细胞RNA测序，共分析105,616个细胞，分为巨噬细胞、T细胞、癌细胞、NK细胞、内皮细胞、肌成纤维细胞、肥大细胞及B/浆细胞八大类。

通过五种独立评分算法对各细胞亚群进行EV特征评分，系统定位了各亚型标志物的细胞来源：

• pRCC中，NEAT1和MMP15主要源自四个分化成熟的癌细胞亚群（pRCC_TMSB4X⁺、DEFB1⁺、MT-ND3⁺、RBP4⁺），其中NEAT1在终末期表达达峰值；

• chRCC中，DSG2和AC026888.1主要来自五个富集氧化磷酸化及硫/硒代谢通路的癌细胞亚群（CCDC141⁺、CRYAB⁺、RARRES3⁺、WFDC2⁺、ATP5F1E⁺）；

• 低级别ccRCC中，NDUFA4L2、SERPINA1、VEGFA、EGLN3、CPE、C6orf223不仅源于三个高评分癌细胞亚群（PDK4⁺、NNMT⁺、CRYAB⁺），还显著表达于肿瘤相关巨噬细胞（TAM），其中SERPINA1和VEGFA在TAM中高度富集；

• 高级别ccRCC中，NDUFA4L2、TGFBI、APOC1、LINC00887同样来自癌细胞（SAA1⁺、STMN1⁺、CD74⁺亚群）和TAM，且APOC1和TGFBI在TAM中尤为突出，高评分癌细胞亚群则富集糖酵解、氧化磷酸化及mTORC1信号通路。

尤其值得关注的是，NDUFA4L2在ccRCC癌细胞中随分级升高表达增加，且多重免疫荧光证实其与上皮标志物共定位，确认了恶性上皮来源。

为进一步验证上述溯源结论，研究者从6例低级别和6例高级别ccRCC新鲜手术标本中分离出原代肿瘤相关巨噬细胞（pTAM），体外培养后提取其分泌的Ti-EV。流式细胞术确认分选细胞高表达CD68和CD206，所获EV呈典型杯状形态、粒径50-200 nm且标志物阳性。ddPCR定量显示，低级别ccRCC的TAM-EV中SERPINA1和VEGFA显著富集，而高级别ccRCC的TAM-EV中APOC1和TGFBI显著富集，与单细胞数据高度一致。此外，高级别ccRCC组织中CD68⁺巨噬细胞密度明显高于低级别，且围绕PANCK⁺癌细胞呈“包围”式分布，提示巨噬细胞浸润密度与肿瘤分级正相关，其分泌的EV可能通过旁分泌方式促进上皮细胞增殖与恶性转化。综合以上结果，低级别ccRCC中促血管生成的VEGFA及抗蛋白酶SERPINA1部分由TAM通过EV分泌，而高级别ccRCC中促转移因子APOC1和TGFBI同样大量来源于TAM。这一发现打破了“癌细胞是EV主要来源”的固有认知，揭示了TAM-Ti-EV在RCC恶性进展中具有主动且被低估的驱动作用。

结语

该研究首次构建了从组织Ti-EV到尿液EV的完整分泌路径，结合机器学习和单细胞测序，鉴定出RCC亚型特异性RNA标志物，并成功实现了基于uEV的ccRCC无创分级。同时，单细胞溯源与原代实验揭示了NDUFA4L2的癌细胞来源 ，而 SERPINA1/VEGFA及APOC1/TGFBI主要来自TAM，揭示了微环境细胞在EV介导的肿瘤进展中的关键作用。尽管pRCC和chRCC的尿液验证尚待扩大样本，但本研究为肾癌精准液体活检提供了理论基础和可转化的候选靶标，也为靶向TAM-EV的治疗策略开辟了新思路。

参考文献

[1] Wu X, et al. Tissue-derived extracellular vesicles enable noninvasive diagnosis of renal cell carcinoma subtypes via urinary EV RNA signatures and single-cell tracing[J].Journal of Extracellular Vesicles, 2026, 15(2): e270221.

*此文仅用于向医疗卫生专业人士提供科学信息，不代表平台立场。