高密度靶向策略!澳大利亚沃尔特-伊莱扎·霍尔医学研究所: 可开辟功能基因组学新途径的全基因组平台

近日，澳大利亚沃尔特-伊莱扎·霍尔医学研究所研究学者在期刊《ScienceAdvances》上发表了研究论文，题为“A high-density CRISPR activation platform for mapping cancer dependencies and resistance pathways ex vivo and in vivo”，本研究推出了Partita，这是一个下一代小鼠全基因组CRISPRa sgRNA平台，专为基因激活研究的卓越效率而设计。Partita采用高密度靶向策略，以最大化转录诱导效果。为了展示Partita的能力，研究人员进行了一系列大规模筛选：体外富集/耗竭筛选、双打击淋巴瘤模型中的全基因组CRISPRa筛选，以揭示促凋亡药物的耐药因子，以及体内筛选以鉴定MYC驱动的淋巴瘤发生的加速因子。每项实验都揭示了预期和非预期的调节因子，且验证率很高。通过实现稳健的功能获得筛选，Partita为功能基因组学开辟了新途径，并扩展了在不同研究领域中发现生物过程关键驱动因子的工具箱。

研究背景

01

CRISPR激活（CRISPRa）是CRISPR技术的一种改良形式，可实现对特定基因的表达调控。传统的CRISPR技术利用Cas核酸酶蛋白（如Cas9），在单链向导RNA（sgRNA）的引导下，于目标位点产生DNA双链断裂。而CRISPRa则不同，它使用经过改造或具备招募转录激活结构域（TADs）能力的无核酸酶活性的Cas蛋白（如dCas9）。当该无核酸酶活性的Cas蛋白与能够将其引导至转录起始位点（TSS）上游启动子区域的sgRNA结合时，即可实现基因的诱导表达。

在体内原代细胞中进行筛选，以揭示MYC驱动的淋巴瘤发生中的致癌因子

02

研究人员利用淋巴瘤中sgRNA的富集情况，对候选癌基因进行优先验证。需要指出的是，Eμ-Myc淋巴瘤通常由一个具有显著生长优势的主导克隆恶性扩增而来，该克隆相较于其他（前）恶性克隆更具优势。因此，研究人员预期从这些肿瘤中回收的sgRNA应与终点检测到的主导克隆相对应。但需要注意的是，约20%的Eμ-Myc淋巴瘤中TRP53肿瘤抑制通路会发生自发性突变，并显著加速淋巴瘤的发生。因此，通过蛋白质免疫印记实验检测稳定化的突变型TRP53蛋白和/或P19ARF蛋白的表达来评估TRP53通路状态。

总体而言，最强的候选基因是Runx2和Runx3，每个基因在两个独立的加速性淋巴瘤样本中均被鉴定出两种不同的sgRNA。值得注意的是，RUNX2和RUNX3的过表达此前已被证实与人类淋巴系和髓系恶性肿瘤的进展相关。研究人员还观察到Csf1r的富集，其表达水平与滤泡性淋巴瘤的不良预后相关。因此，我们选择靶向Runx2、Runx3和Csf1r的sgRNA，在独立的FLC重建实验中进行验证，以评估它们促进MYC驱动的淋巴瘤发生潜能。每种sgRNA均独立验证可加速MYC驱动的淋巴瘤发生，所有受体小鼠在实验终点时均表现出典型的淋巴瘤病理特征。通过qRT-PCR检测来自这些小鼠肿瘤的细胞系中各靶基因的转录激活情况，结果显示，与sgNTC样本相比，每种感兴趣的sgRNA均显著上调了相应靶基因的表达。这些结果表明，Partita作为一种发现和研究参与淋巴瘤发展的基因以及用于体内筛选应用的工具具有重要价值。

在池化体内CRISPRa筛选中使用Partita鉴定加速MYC驱动的pre-B/B淋巴瘤发生的癌基因

参考资料：

https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.aec0722-contributors

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