JBC｜李福川团队发现 4-O-硫酸化特异性软骨素酶 A（CSase A）

糖胺聚糖是一类广泛分布于动物细胞表面和细胞外基质的线性聚阴离子多糖，主要包括透明质酸（HA）、硫酸软骨素/硫酸皮肤素（CS/DS）、肝素/硫酸乙酰肝素（Hep/HS）和硫酸角质素（KS）。作为蛋白聚糖的重要糖链组分，GAGs通过与生长因子、趋化因子、细胞黏附分子及细胞外基质蛋白等相互作用，参与细胞增殖、迁移、分化、组织发育、炎症、感染和肿瘤发生等各种生理病理过程。

近日， 山东大学国家糖工程技术研究中心李福川教授和王文爽研究员团队在Journal of Biological Chemistry在线发表了题为Discovery and characterization ofChondroitinaseA with specificity for 4-O-sulfated N-acetylgalactosamineinChondroitin sulfate/Dermatan sulfate的研究论文。该研究从我国南海海马冷泉沉积物宏基因组中发现并系统鉴定了首个硫酸软骨素酶A（chondroitinase A，CSase A），填补了硫酸软骨素/硫酸皮肤素特异性降解工具酶体系中的一项重要空白。

CS/DS结构研究长期缺少“A型”特异性工具酶

CS和DS由葡萄糖糖醛酸/艾杜糖醛酸（GlcA/IdoA）与N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）组成的二糖单元重复链接而成线性硫酸化多糖，其结构和生物学功能很大程度上取决于糖链中二糖单元的硫酸化模式。根据硫酸化模式的不同，CS糖链中常见的二糖单元包括：O（GlcA-GalNAc）、A（GlcA-GalNAc4S）、C（GlcA-GalNAc6S）、D（GlcA2S-GalNAc6S）、E（GlcA-GalNAc4S6S）、T（GlcA2S-GalNAc4S6S）等；当CS糖中的GlcA异构化为DS糖链中的IdoA时，DS的二糖单元加“i”前缀，如DS中最常见到的二糖单元iO（IdoA-GalNAc）、iA（IdoA-GalNAc4S）、iB（IdoA2S-GalNAc4S）等。其中，含有GalNAc 4-O-硫酸化的A/iA二糖单元，是哺乳动物组织CS/DS中含量最丰富的硫酸化结构。例如，哺乳动物软骨来源CS通常含有超过60%的A单元，因此传统上被称作CS-A，而皮肤和肠黏膜来源DS则以iA单元为主。

这些4-O-硫酸化结构参与关节软骨稳态、肿瘤进展及病原感染等过程。例如，疟原虫蛋白VAR2CSA可以识别富含特定4-O-硫酸化结构的CS糖链；类似结构还被发现在多种肿瘤组织中异常表达，因而被认为具有泛癌诊断和靶向治疗潜力。

微生物来源的硫酸软骨素酶是研究CS/DS结构与功能的重要工具。此前，人们已经发现了底物谱较宽的CSase ABC、选择性降解CS而不能降解DS的CSase AC、特异性作用于DS的CSase B，以及偏好GalNAc 6-O-硫酸化区域的CSase C。然而，长期以来，能够选择性降解富含A/iA单元区域的“CSase A”始终未被发现，限制了对这类优势结构域生物学功能的深入研究。

深海冷泉宏基因组揭示新型PL8家族裂解酶

研究团队从海马冷泉沉积物宏基因组中筛选获得了一个新的GAG裂解酶基因。该基因编码952个氨基酸，其蛋白属于多糖裂解酶家族8（PL8），但与已报道硫酸软骨素酶的最高氨基酸序列同源性不足30%，提示其具有较大的结构和功能差异。

重组表达和酶学分析表明，该酶是一种内切型CS/DS裂解酶，对富含A/iA单元的CS-A和DS具有较高活性。其最适反应温度为10 ℃，在0～20 ℃条件下孵育24小时后仍可保持约90%的活性，表现出与深海冷泉来源相适应的低温催化特征。

在不同CS/DS底物中，CSase A对CS-A和DS的活性最高，而对富含C、D、E或iB等二糖单元的底物活性显著降低。该酶不依赖金属离子，并可在乙酸铵等质谱兼容的挥发性缓冲体系中保持较高活性，有利于其与HPLC和质谱分析技术联用。

严格识别4-O-硫酸化或非硫酸化GalNAc结构

为了确定CSase A的真实底物选择性，研究人员采用时间梯度酶解、凝胶过滤色谱、阴离子交换HPLC、质谱分析以及课题组建立的寡糖酶法测序技术，对其降解产物进行了系统分析。

结果显示，虽然天然CS/DS底物的硫酸化结构高度不均一，但CSase A释放的二糖产物几乎全部为含GalNAc 4-O-硫酸化的ΔA单元。以CS-A为底物时，ΔA单元占最终二糖产物的93.06%，而含GalNAc 6-O-硫酸化的ΔC单元则主要富集在酶解后残留的四糖和六糖中。

进一步的结构解析发现，CSase A抗性四糖主要为ΔC-C和ΔA-C，抗性六糖主要为ΔA-C-C和ΔC-C-C，这些寡糖均在相应的还原端区域含有C单元。由此说明，GalNAc的6-O-硫酸化会对CSase A的切割形成明显阻碍。

研究人员随后利用一系列结构明确的四糖进一步验证了这一规律。结果表明，当待切割位点相邻的二糖单元为A单元或非硫酸化O单元时，CSase A能够有效切割；当该位置含有C、D、E或iB单元，即存在GalNAc 6-O-硫酸化、糖醛酸2-O-硫酸化或其他复合硫酸化修饰时，酶切反应则受到抑制。

因此，CSase A并非简单地以“是否含4-O-硫酸基”为唯一识别条件，而是严格要求催化位点相关的GalNAc为非硫酸化或4-O-硫酸化状态，同时排斥GalNAc 6-O-硫酸化和糖醛酸2-O-硫酸化结构。这种独特的选择性使其明显区别于此前报道的CSase ABC、AC、B和C，确立了其作为首个CSase A亚家族代表酶的地位。

初步阐明CSase A的催化机制

基于同源结构建模和定点突变分析，研究团队鉴定出His-420、Tyr-427、Arg-480和Glu-579四个对酶活性具有重要作用的氨基酸残基。

其中，His-420突变后，酶对CS-A和DS的降解活性完全丧失，表明其可能直接参与催化过程中的质子转移；Tyr-427突变导致酶对CS-A失去活性，但仍保留部分DS降解能力，提示该残基可能同时参与底物识别和选择性控制；Arg-480和Glu-579突变则造成酶活性显著下降，可能在底物定位或过渡态稳定中发挥作用。

结合CSase A不依赖金属离子的特征，研究人员推测该酶可能采用由Tyr-His参与的酸碱催化机制。不过，其精确的底物结合方式和硫酸基识别机制仍有待通过酶与底物复合物的高分辨率结构进一步阐明。

为CS/DS精准结构解析与功能寡糖制备提供新工具

CS/DS糖链具有高度复杂的硫酸化和糖醛酸差向异构化结构，传统化学降解方法难以实现特定位点的可控切割。CSase A的发现，为选择性识别和降解A/iA单元富集区域提供了新的酶学工具。

该酶可用于研究4-O-硫酸化CS/DS结构域在肿瘤、关节疾病、感染和组织发育等过程中的功能；也可与其他底物特异性糖胺聚糖酶及硫酸酯酶组合，用于复杂CS/DS糖链的结构解析和序列测定。此外，通过选择性去除A/iA结构域，还可以富集或制备具有其他特定硫酸化模式的功能寡糖，为糖类药物、诊断试剂及精准糖工程产品的开发提供技术基础。

持续完善糖胺聚糖精准降解与结构解析工具体系

近年来，李福川教授团队围绕“新型糖胺聚糖降解酶的发现、催化机制及应用”开展了系统研究，从海洋、肠道及其他特殊环境微生物中持续挖掘具有独特底物谱和作用方式的工具酶，CSase A的发现正是这一系统工程的自然延伸。

在肝素酶研究方面，团队发现肝素外切酶家族exoHepases，从结构层面阐明了其独特的底物进入和产物释放的独特外切机制，并建立了基于该酶的Hep/HS寡糖酶法测序技术，填补了Hep/HS研究领域长期缺乏肝素外切酶的空白（Nat. Commun. 2021）。

在广谱GAG降解酶方面，团队发现了一类属于PL35家族、能够跨越传统底物分类界限降解HA、CS及HS等多类糖胺聚糖的新型GAGase，并通过结构生物学和酶学研究揭示了其广谱底物识别与催化基础（J. Biol. Chem. 2024；eLife 2025）。

在硫酸软骨素/硫酸皮肤素相关工具酶方面，团队已建立起一套完整的工具酶谱系：2014年报道了首个海洋细菌来源HA和CS裂解酶HCLase（J. Biol. Chem.）；2015年首次发现并系统表征了第一个内切型CS/DS 4-O-硫酸酯酶（J. Biol. Chem.）；2017年开发了可用于CS/DS寡糖测序的外切酶HCDase（Biochem. J.）；2018年发现被E单元选择性抑制的新型HA/CS裂解酶HCLase Er（J. Biol. Chem.）；2019-2023年又陆续报道了多个新型硫酸酯酶并深入解析其作用机制（Biochem. J.、Carbohydr. Polym.）。从GAG裂解酶到硫酸酯酶，团队的工具酶图谱逐步完善，而本次首个CSase A的发现，正是补上了A型4-O-硫酸化特异性这一经典分类中长期缺位的关键一块拼图，进一步补充了针对不同CS/DS硫酸化结构域的选择性降解工具，为逐步建立覆盖糖链降解、脱硫酸化、寡糖分离和序列测定的糖胺聚糖精准分析技术体系奠定了基础。

该论文由山东大学国家糖工程技术研究中心李福川教授和王文爽研究员团队完成。王文爽研究员为论文第一作者，李福川教授为通讯作者。

论文链接： https://doi.org/10.1016/j.jbc.2026.113594

制版人：十一

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