胶原水凝胶，最新Nature大子刊！

水凝胶局部递送Treg诱导剂促进骨再生

调节性T（Treg）细胞能够抑制过度免疫激活，增加体内Treg水平已在治疗自身免疫病、促进组织修复和预防移植排斥方面显示潜力。然而，当前Treg免疫治疗主要依赖过继Treg转移，需要体外扩增自体Treg后再回输，面临Treg来源变异、组织特异性靶向困难、快速可扩展扩增方法不足以及多克隆扩增Treg缺乏抗原特异性等问题；体外扩增耗时，限制急性状况的及时干预，全身给予Treg还可能增加广泛免疫抑制及感染等风险。局部增加Treg细胞群因此成为有前景的替代思路，尤其对于解剖上局限的损伤，短暂Treg激活可能足以调节免疫反应并支持修复。局部、持续地原位激活Treg，是提升组织修复效果的关键方向。

哈佛大学David J. Mooney课题组报道了一种胶原水凝胶系统：该水凝胶以胶原为基质，负载超过其溶解度极限的CDK8/19抑制剂AS2863619（AS）以实现溶解控制释放，并可引入锂皂石纳米颗粒通过静电作用进一步延缓AS释放、延长局部滞留，从而在损伤部位原位诱导并稳定Treg。持续暴露于Treg诱导剂可稳定CD4+ T细胞中的Foxp3表达，实现Treg诱导和稳定；加入锂皂石后，AS释放进一步减慢、药物滞留延长。在颅骨骨缺损模型中，载AS水凝胶剂量依赖地诱导Treg细胞激活，减少促炎巨噬细胞反应并增强骨再生；AS-锂皂石水凝胶在部分病例中实现完全缺损桥接。该水凝胶无需细胞分离和扩增，即可对Treg群体提供时空控制，为免疫调节和组织修复提供可扩展的替代方案。相关论文以“Hydrogel for sustained and localized delivery of a regulatory T cell-inducing agent promotes bone regeneration”为题，发表在Nature Biomedical Engineering 上。

研究首先确认诱导性Treg（iTreg）的免疫抑制特性，并从局部递送与全身递送比较入手。方法上，从脾中分离CD4+ T细胞，经TGFβ培养6天分选Foxp3+CD25+ iTreg，再与应答T细胞（Tresp）按不同比例共培养，发现1:1比例可完全抑制Tresp增殖，至8:1比例仍保持抑制（图1a–d）。随后在4 mm临界尺寸颅骨缺损小鼠中比较2×10⁵ iTreg静脉注射与包埋于载IL-2胶原水凝胶的局部递送，4周后无iTreg水凝胶未见骨再生，静脉给药也未显著促进再生，而局部包埋iTreg使缺损面积显著减少约40%、矿化体积增加约50%，但再生反应存在变异（图1e–g）。这一结果说明局部提高Treg比全身给药更有利于骨再生，也提示需要更稳定、可扩展的原位Treg诱导策略。

图1局部递送iTreg细胞增强临界尺寸颅骨缺损愈合。

在确认局部Treg治疗潜力后，研究转向用药物递送系统原位诱导并稳定Treg。方法上，先比较AS与TGFβ暴露2天或6天后撤药培养24小时的Foxp3稳定性，发现仅暴露6天的iTreg能维持Foxp3表达，暴露2天者明显丢失，说明延长暴露对稳定Treg表型至关重要（图2a–d）。据此设计胶原水凝胶持续释放AS：20 μg低于PBS pH 7.4中的溶解度阈值，100 μg超过阈值；100 μg水凝胶可持续释放至第11天，20 μg水凝胶第3天即释放完全，较高负载将24小时突释从74±5%降至26±2%，半衰期从0.33±0.03天延长至3.4±0.1天，Franz扩散池显示胶原不影响AS扩散，释放的AS仍保持诱导iTreg的生物活性（图2e–l）。这表明胶原水凝胶可实现AS的持续、局部释放并维持其生物活性，为原位稳定Treg提供了递送基础。

图2持续暴露于AS是生成稳定Treg表型所必需，胶原水凝胶可实现AS持续释放。

在明确递送系统可行后，研究评估AS对固有免疫细胞的影响，以判断其免疫调节选择性。方法上，用0.1、1、10 μM AS处理骨髓来源巨噬细胞和树突状细胞，结合UMAP和表面标志流式分析，并检测抗原呈递及OT-I/OT-II T细胞增殖。结果显示各浓度AS均无细胞毒性，0.1 μM AS不显著改变巨噬细胞活化标志，主要增加树突状细胞CD80、CD86和MHC II等活化标志，CD40略降；较高AS浓度增加CD80等标志。AS不增强MHC I抗原呈递，也不影响OT-I CD8+和OT-II CD4+ T细胞增殖，而TGFβ则明显降低这些指标；对LPS+IFNγ预激活的巨噬细胞，低剂量AS降低CD80，较高剂量使CD80回升趋近对照，TGFβ主导CD206+CD80−表型（图3a–f）。总体而言，AS在低浓度下选择性诱导Treg，与TGFβ相比对树突状细胞影响较小，并剂量依赖调节巨噬细胞活化。

图3AS在低浓度选择性诱导Treg，与TGFβ相比对树突状细胞影响较小，并剂量依赖调节巨噬细胞活化。

在体外免疫调节特征明确后，研究将AS胶原水凝胶植入颅骨缺损，验证局部Treg增加与骨再生的关系。方法上，植入含100 μg或1000 μg AS的胶原水凝胶，第7天流式分析缺损局部和外周血Treg及巨噬细胞表型，并于4周和8周进行μCT评估，并结合组织学分析。结果显示缺损局部Treg呈剂量依赖增加，从空白凝胶中CD4+ T细胞的5±1%升至1000 μg AS组的17±10%，外周血Treg保持约5%，其他T细胞群无显著变化；较高AS剂量显著降低缺损部位CD206−CD80+巨噬细胞比例及CD80信号。骨再生方面，空白凝胶在4周和8周均无再生迹象，AS水凝胶第4周在缺损核心出现组织矿化并持续至第8周，缺损面积随AS负载增加呈下降趋势但未完全闭合，矿化主要位于缺损核心，组织学显示AS处理缺损内组织更厚、细胞浸润更密，且作用主要在愈合早期（图4a–l）。局部AS递送可剂量依赖增加Treg、降低促炎巨噬细胞反应并促进早期矿化，但单靠AS释放仍不足以实现完全愈合。

图4局部递送AS增加Treg细胞群并促进临界尺寸颅骨缺损模型中的新组织矿化。

为延长AS释放并增强免疫调节持续时间，研究利用AS与带电荷锂皂石纳米颗粒之间的静电作用将其保留在水凝胶中。方法上，制备AS-锂皂石胶原水凝胶，检测释放曲线、NaCl干扰及水凝胶消化后残留AS，并植入4 mm颅骨缺损，动态分析Treg积累，4周后以μCT和组织学评估骨再生，同时与IL-2复合物给药比较。结果显示AS-锂皂石水凝胶初始突释为19±2%，随后15天持续释放，17天消化后仍检测到残留AS，加入200 mM NaCl破坏静电作用后释放曲线与无锂皂石凝胶相似，说明静电作用是主要保留机制；植入750 μg AS-锂皂石后，第7天缺损局部Treg显著高于空白，第8、9天Treg百分比和总数高于AS单独组，Foxp3 MFI增加；AS-锂皂石降低CD206−CD80+巨噬细胞仅呈趋势，载AS水凝胶还降低IFNγ+细胞和CD3+ IFNγ+ T细胞；4周μCT显示缺损面积减少、矿化体积增加，部分实现完全桥接，组织学支持新组织形成，与IL-2复合物给药的比较显示缺损、血和脾中Treg积累存在差异（图5a–h）。锂皂石介导的AS滞留可延长局部免疫调节并进一步增强骨再生，部分病例实现完全缺损桥接。

图5通过含锂皂石胶原凝胶延长释放AS，延长暴露增强临界尺寸骨缺损再生。

该生物材料策略在损伤部位建立局部耐受性微环境，绕过过继Treg转移的高成本、制备时间长、体内持久性低和全身免疫抑制风险；胶原水凝胶通过溶解控制释放减少突释并延长释放，锂皂石通过静电作用进一步延长滞留，释放AS保持生物活性。AS-锂皂石水凝胶可缩小缺损并在部分病例实现完全桥接，但AS主要作用于早期免疫调节而非直接成骨，8周组织学显示AS单独可能不足以完全愈合；Treg影响再生的具体机制尚需研究。转化方面，目前尚无AS或相关CDK8/19抑制剂的人体剂量数据，剂量可能随缺损体积而非体重缩放，仍需大动物和早期临床研究确定安全性、药代/药效参数以及诱导有效Foxp3表达的浓度。该平台为无需细胞分离扩增的原位Treg激活提供了可扩展替代，并可能拓展至其他需要局部免疫调节的组织损伤和靶向药物递送场景。