AFM丨葛广波、郭兆彬团队：新型血管化肺癌类器官芯片助力抗转移药物精准评价

近日， 上海中医药大学葛广波研究员、郭兆彬青年研究员团队与澳大利亚南澳大学Chih-Tsung Yang研究员团队合作，在国际期刊Advanced Functional Materials发表题为A Vascularized Lung Tumoroid-on-a-Chip Model for the Accurate Assessment of Anti-Invasion Agents的研究论文。该研究成功构建了一种新型血管化肺癌类器官芯片平台，实现了对肿瘤-血管交互作用的动态可视化与精准量化，为抗非小细胞肺癌转移药物筛选与机制研究提供了强有力的工具。现将其研究背景、核心发现及学术贡献作一梳理介绍。

肺癌是全球癌症相关死亡的首要原因，其中非小细胞肺癌占比超过 85% ，其五年生存率仅约 5% 。肿瘤转移是导致患者死亡的核心原因，也是临床治疗失败的主要因素。然而，目前抗转移药物研发面临一个关键瓶颈：缺乏能够精准模拟肿瘤 - 血管交互、动态再现转移关键事件的临床前模型。传统模型存在三大局限：一是二维划痕或 Transwell 法无法实现肿瘤细胞与血管内皮细胞的直接三维接触；二是动物模型难以在单细胞水平实时观测肿瘤细胞与血管的动态互作；三是替代性血管化过程 —— 包括 血管嵌合体 、血管生成拟态及血管共定位等 —— 因缺乏可视化模型而长期被忽视。而恰恰是这些非经典血管化途径，构成了肿瘤逃避抗血管生成治疗的重要耐药机制。针对这一科学问题，研究团队自主研发了血管化肺癌类器官芯片模型，成功实现了对血管嵌合体形成过程的实时追踪与定量分析。

1） 血管化肺癌类器官芯片模型的构建与功能验证

研究团队采用预埋镍钛丝 - 胶原凝胶 - 内皮化灌注策略，在聚二甲基硅氧烷（ PDMS ）微流控芯片中构建了直径 220 μm 、衬有人脐静脉内皮细胞的单层可灌注微血管。将预先形成的肺癌类器官（ A549 、 H460 及患者来源循环肿瘤细胞株 CTC-TJH-01 ）分散于 I 型胶原溶液中，注入芯片腔室，待胶原凝胶化后拔出镍钛丝形成中空通道，随后接种 HUVECs 并在持续灌注条件下建立完整、具备屏障功能的微血管。该配置实现了肿瘤类器官与内皮细胞的直接三维接触，灌注剪切力为 4 dynes/cm² ，模拟毛细血管后微静脉生理环境。

实验结果表明，三株肺癌细胞系形成的类器官在芯片内呈现相近的生长动力学， 5 天内相对生长面积无统计学差异。肿瘤类器官与内皮细胞共培养组与无内皮对照组相比，类器官生长速率无显著差异，且类器官初始面积（ 20000–80000 μm² 范围内）及与血管距离均与生长速率无相关性，证实模型具备良好的稳定性和可重复性。

为评估微血管屏障完整性及肿瘤诱导的屏障破坏，研究团队在血管内皮化后第 2 天向管腔内灌注分子量 70 kDa 的异硫氰酸荧光素标记葡聚糖，该分子量与人血清白蛋白相当。荧光成像及通透系数定量显示，不含肿瘤类器官的空白芯片中微血管屏障功能完好， FITC- 葡聚糖渗漏极微；而含肿瘤类器官的 VLTOC 芯片中， FITC- 葡聚糖向胶原凝胶扩散显著增加，即使远离肿瘤 - 血管直接接触区域的血管段亦呈现明显渗漏。定量分析显示，含肿瘤组血管通透系数较空白组升高约 2 倍，差异具有统计学意义。该结果表明，肿瘤类器官可通过旁分泌或间接机制破坏微血管屏障功能，成功复现肿瘤相关血管的增强渗透与滞留效应。

2）VLTOC 模型转录组学特征揭示恶性进展相关通路显著富集

为解析 VLTOC 模型中肿瘤细胞的分子表型特征，研究团队对 VLTOC 培养的 A549 细胞、常规三维肿瘤球体及二维培养细胞进行 RNA 测序及比较转录组学分析。主成分分析显示， VLTOC 样本与 3D 球体样本呈现显著的转录谱分离，提示 VLTOC 微环境驱动了肿瘤细胞深度的转录重塑。

差异表达基因分析显示，与 3D 球体相比， VLTOC 中显著上调基因 2953 个，显著下调基因 2830 个。功能注释表明，上调基因显著富集于肿瘤代谢、增殖、转移及血管生成等关键恶性进程相关功能模块。具体基因层面，代谢相关基因 PRR11 、 CDK1 、 CDK2 ，增殖标志基因 MKI67 、 CCN2 、 ABLIM2 ，侵袭转移相关基因 FLT1 、 MMP1 、 MMP2 ，血管生成相关基因 CD93 、 ESM1 、 ANGPT2 等在 VLTOC 中均呈现显著高表达。

WikiPathways 通路富集分析进一步揭示，相较于 3D 球体， VLTOC 模型中肿瘤相关通路显著富集，包括线粒体复合物 II 组装、 IL-24 信号通路、 VEGFR2 介导信号级联等。基因集富集分析显示，细胞周期、 IL-24 信号、 VEGFA-VEGFR2 信号通路在 VLTOC 中显著上调。上述结果共同表明， VLTOC 模型中的肿瘤细胞呈现代谢重编程、增殖能力增强、血管生成活性及侵袭潜能升高的表型特征，与临床肿瘤恶性进展的关键标志高度吻合。

3） 血管嵌合体形成过程的动态可视化与量化分析

血管嵌合体指内皮细胞部分被肿瘤细胞替代、形成肿瘤细胞 - 内皮细胞混杂共构的血管壁结构，该形态与肿瘤患者不良预后密切相关，但长期缺乏可动态观测的体外模型。

本研究通过共聚焦三维重建及免疫荧光染色，首次在芯片模型中清晰捕获 血管嵌合体 的立体结构。 XY 、 YZ 、 XZ 三轴断层扫描显示，红色荧光标记的 A549 肿瘤细胞嵌入绿色荧光标记的 HUVEC 单层，向血管腔内突起，形成典型镶嵌形态。 VLTOC 切片免疫荧光染色进一步确认 血管嵌合体 结构： Ki67 阳性肿瘤细胞簇占据 CD31 阳性内皮层间隙，该形态特征与裸鼠移植瘤组织切片的免疫荧光染色结果高度一致。值得注意的是， 血管嵌合体 区域的内皮细胞亦呈现 Ki67 阳性，提示其获得增殖性肿瘤相关内皮表型； MMP2 在肿瘤细胞与内皮细胞中均有共表达，提示内皮细胞发生表型转化，获得促基质重塑及促侵袭能力。

为表征 血管嵌合体 生长动力学，研究团队以首次检出 血管嵌合体 的时间点为 M0 ，进行每日连续成像追踪。结果显示， 血管嵌合体 形成后前两日内扩张加速，表现为肿瘤细胞沿血管壁纵向扩展、内皮层缺损进行性扩大。定量统计表明， 31% 的血管旁肿瘤类器官形成 血管嵌合体 ，其中 71% 的 血管嵌合体 事件发生于内皮化后 2 天内，第 2 天达发生率峰值。三株细胞系中， A549 来源类器官呈现最高的 血管嵌合体 发生率及第 5 天最大扩张面积。内皮细胞存在与否的对比实验显示，无内皮衬覆通道中肿瘤类器官对中空通道的侵入率及侵入面积均显著高于内皮化通道，证实完整内皮屏障对肿瘤侵袭及 血管嵌合体 起始具有抑制性调控作用。

4）细胞骨架重塑是驱动 血管嵌合体 形成与进展的关键机制

为解析 血管嵌合体 形成的分子驱动机制，研究团队整合转录组学分析与功能验证实验。基因集富集分析显示，相较于 3D 球体模型， VLTOC 模型中微管骨架调控通路显著富集， CDK1 、 KIF2C 、 STMN1 、 AURKB 等微管动态相关基因显著上调； F- 肌动蛋白相关通路未达统计学显著水平。

免疫荧光染色对转录组发现进行蛋白水平验证。结果显示， VLTOC 中微管蛋白荧光强度较 3D 球体显著升高， F- 肌动蛋白荧光强度亦呈现显著上调，与转录组数据部分差异可能源于转录 - 翻译事件的时间滞后。该结果支持细胞骨架动态重构可能是肿瘤侵袭与 血管嵌合体 形态发生的汇聚机制。

为功能验证该假说，研究团队通过血管腔内灌注途径分别给予微管聚合抑制剂 tubulin inhibitor 6 、 F- 肌动蛋白装配抑制剂 Cytochalasin D 、 Rho 激酶通路抑制剂 Y-27632 。三类抑制剂处理均未对肿瘤类器官增殖活性及细胞活力产生显著影响，但均显著抑制 血管嵌合体 的发生与扩张。其中， F- 肌动蛋白抑制几乎完全阻断 血管嵌合体 形成； ROCK 通路阻断 —— 作为细胞骨架收缩性的关键调控节点 —— 显著削弱 血管嵌合体 的起始与进展。上述结果共同确立细胞骨架动态重塑作为 血管嵌合体 形成及肿瘤相关血管共选的关键驱动力。

5） 基于肿瘤生长、血管嵌合体动力学及健康微血管损伤的三维度药效评价体系建立

为验证 VLTOC 模型在药物测试中的临床转化价值，研究团队选取 5 种临床获批的非小细胞肺癌化疗药物 —— 紫杉醇、顺铂、伊立替康、奥沙利铂、吉西他滨 —— 进行系统评估。采用基于单层培养 A549 细胞 IC50 几何均值（约 140 nM ）的标准化给药剂量 100 nM ，通过持续血管腔灌注给药，对肿瘤类器官增殖、 血管嵌合体 动力学、健康微血管屏障完整性进行并行量化。

肿瘤类器官生长追踪显示，紫杉醇与吉西他滨对肿瘤类器官增殖呈现显著抑制作用，而顺铂、伊立替康、奥沙利铂在 100 nM 剂量下未显示统计学显著的肿瘤生长抑制效应。

血管嵌合体 动力学分析显示，紫杉醇与吉西他滨显著降低 血管嵌合体 发生率及扩张速率；伊立替滨选择性抑制 血管嵌合体 扩张速率而不影响发生率；顺铂与奥沙利铂对两项指标均无显著调节作用。

针对化疗药物脱靶血管毒性，研究团队在无肿瘤类器官的健康微血管模型中评价药物对血管屏障功能的损害。除奥沙利铂外，其余 4 种化疗药物处理均导致 FITC- 葡聚糖外渗显著增加，血管通透系数较对照组显著升高，表明治疗剂量的紫杉醇、顺铂、伊立替康、吉西他滨可对健康脉管系统造成脱靶损伤，而奥沙利铂在所测试化疗药物中呈现最佳血管安全性。该结果与临床报道的化疗相关血管毒性谱系高度一致。

6） 血管嵌合体扩张速率与 TCGA 药物敏感性预测呈现强相关性

为评估 VLTOC 模型的药物筛选预测准确性，研究团队基于癌症基因组图谱肺腺癌队列数据， 采用 Onco-predict 机器学习算法对 5 种化疗药物的敏感性进行预测，并与 VLTOC 实测结果进行系统比较。

通过单变量回归及 LASSO 回归递进分析，从 VLTOC 差异表达基因中筛选出 112 个与 TCGA 肺腺癌患者生存不良相关的候选特征，进一步经多变量回归鉴定出 11 个基因作为独立预后风险因子，包括 FAM83A 等既往报道经 HIF-1α/ 糖酵解轴促进肺癌侵袭的关键分子。功能注释显示，该 11 基因集主要参与肿瘤代谢调控、活性氧稳态及微小 RNA 调控网络。

基于 11 基因构建的预后列线图成功将 TCGA 患者划分为高风险组与低风险组， Kaplan-Meier 生存分析证实高风险组患者生存概率显著低于低风险组，时间依赖性受试者工作特征曲线显示 1 年、 3 年、 5 年生存预测的曲线下面积分别为 0.82 、 0.75 、 0.71 ，预测效能良好。

基于该 11 基因特征集，研究团队采用 Onco-predict 算法计算 5 种化疗药物的敏感性评分，并与 VLTOC 实测的肿瘤生长抑制率及血管嵌合体扩张抑制率进行相关性分析。结果显示，药物敏感性预测评分与肿瘤生长抑制率呈中等程度相关，未达统计学显著水平；而与血管嵌合体扩张抑制率呈现强相关性， Pearson 相关系数 r=0.9828 ， P=0.0027 。该结果表明，血管嵌合体扩张速率相较于传统肿瘤生长指标，是与临床药物敏感性更具预测一致性的量化指标，确立其作为抗肿瘤转移药物疗效评价核心指标的价值。

7） 中药药效物质 楝酰胺在 VLTOC 模型中呈现抗侵袭、低血管毒性、促免疫粘附三重药理特征

为进一步验证 VLTOC 平台对候选化合物药效及作用机制的预测能力，研究团队选择来源于楝科植物的天然活性成分楝酰胺（ RocA ）作为验证对象。 RocA 既往报道具有抗非小细胞肺癌活性，但其对肿瘤 - 血管交互及血管嵌合体形成的影响尚未阐明。

基于二维细胞毒性与划痕迁移实验，确定 RocA 对 A549 细胞的 IC50 为 88.6 nM ， 100 nM 剂量下显著抑制细胞迁移。据此在 VLTOC 模型中设置 100 nM 、 50 nM 、 20 nM 三个给药剂量。结果显示， RocA 呈剂量依赖性抑制肿瘤类器官生长， 50 nM 及以上剂量对血管嵌合体发生率及扩张速率均呈现显著抑制效应。值得注意的是，与紫杉醇、吉西他滨、伊立替康等传统化疗药物不同， RocA 在 100 nM 有效抗肿瘤剂量下未对微血管屏障完整性造成显著损伤，血管通透系数与对照组无统计学差异，提示其具备潜在的治疗窗口优势。

为解析 RocA 在 VLTOC 模型中的分子机制，研究团队对 100 nM RocA 处理 24 小时的 VLTOC 样本进行转录组测序。差异表达基因分析鉴定出 237 个显著变化基因，通路富集分析显示 II 型干扰素信号、 TWEAK 信号通路、 TNFα 信号通路等免疫调控相关通路在 RocA 处理组显著激活，与既往报道 RocA 通过 cGAS-STING 通路激活非小细胞肺癌中 NK 细胞浸润、增强抗肿瘤免疫的发现高度一致。

为定量评估 RocA 的免疫调节效应，研究团队在 VLTOC 平台中建立流动免疫细胞粘附实验体系。经 RocA 预处理 48 小时后，将荧光标记的 THP-1 单核细胞以 10⁶/mL 浓度在生理剪切应力下灌注通过微血管腔 10 分钟，随后以新鲜培养基持续灌注 15 分钟洗去非粘附细胞。定量分析显示， RocA 处理组微血管壁粘附 THP-1 细胞密度较对照组显著升高。在 4 dynes/cm² 生理剪切应力下持续灌注 24 小时后， RocA 处理组仍维持显著更高的 THP-1 滞留比例。该结果从功能层面证实 RocA 促进免疫细胞与肿瘤血管壁的稳定粘附，为 RocA 联合免疫治疗的潜在应用提供实验依据。

8）VLTOC 模型药效观察与动物模型平行验证呈现高度一致性

为评估 VLTOC 模型药效数据的体内转化一致性，研究团队构建 A549 裸鼠皮下移植瘤模型，系统研究 RocA 的抗肿瘤疗效与系统毒性。荷瘤小鼠随机分为两组，治疗组每 48 小时腹腔注射 RocA 2 mg/kg ，对照组给予等体积溶媒，连续给药 14 天。

长期肿瘤体积追踪显示， RocA 治疗组自给药第 8 天起肿瘤体积增长显著缓于对照组，终点肿瘤体积及瘤重均显著低于对照组。肿瘤组织 HE 染色显示，对照组肿瘤细胞核形态保存、胞质结构完整， RocA 治疗组肿瘤组织呈现广泛空泡化 —— 细胞损伤典型形态学标志。 Ki67 免疫组化染色定量证实 RocA 治疗组肿瘤细胞增殖活性显著受抑。

为表征血管嵌合体在动物模型中的存在及 RocA 的干预效应，研究团队对肿瘤组织切片进行 CD31/Ki67 及 CD31/TTF-1 双重免疫荧光染色。共定位分析显示，对照组肿瘤组织中存在 CD31 阳性内皮层被 Ki67 阳性或 TTF-1 阳性肿瘤细胞簇占据的血管嵌合体结构， RocA 治疗组血管嵌合体占所有血管样结构的比例显著下降。该结果与 VLTOC 模型观测到的 RocA 抑制血管嵌合体发生率及扩张速率高度吻合。

肿瘤组织 CD45 免疫组织化学染色显示， RocA 治疗组肿瘤内白细胞浸润面积显著高于对照组，提示 RocA 促进肿瘤免疫浸润，与 VLTOC 中 THP-1 粘附增加的功能实验结果相互印证。主要脏器 HE 染色显示，心、肝、脾、肺、肾组织形态在两组间未见明显差异，核仁结构保存、无病理空泡化，提示 RocA 在有效剂量下未造成显著器官毒性。

上述动物模型数据与 VLTOC 平台在抗肿瘤增殖、抑制血管嵌合体、维持血管完整性、促进免疫粘附等维度的观测结果呈现高度一致性，系统验证了 VLTOC 模型的体内转化预测效能。

本研究构建了血管化肺癌类器官芯片平台，并建立了基于肿瘤生长、血管嵌合体动力学、健康血管损伤三维度的药效评价体系，取得以下进展：

模型创新层面，在体外实现血管嵌合体形成过程的动态可视化与单细胞分辨率实时追踪，填补了替代性血管化体外模型的长期空白。该平台采用胶原基质三维共培养、生理剪切力灌注、患者来源细胞整合等设计要素，在肿瘤 - 血管交互复现度与定量可控性方面较传统模型形成本质提升。

机制发现层面，整合转录组学、蛋白水平验证与功能干预实验，确立细胞骨架动态重塑作为血管嵌合体起始与进展的核心驱动力。该发现将细胞骨架调控从肿瘤细胞内在迁移能力的经典范畴拓展至肿瘤 - 血管结构重构的新型功能维度。

方法学层面，建立以血管嵌合体扩张速率为核心指标的抗转移药效评价方法。基于 5 种临床化疗药物及 TCGA 机器学习药物敏感性预测的关联分析显示，血管嵌合体扩张抑制率与临床药物敏感性预测评分的相关性显著强于传统肿瘤生长抑制指标。该发现将血管嵌合体动力学确立为兼具机制关联性与临床转化预测价值的药效量化指标。

转化验证层面，通过临床化疗药物、候选天然产物、患者数据机器学习预测、动物模型平行验证的四级验证体系，系统论证了 VLTOC 平台的药物筛选效能与临床预测一致性。楝酰胺在芯片 - 动物双模型中呈现抗侵袭、低血管毒性、促免疫粘附的三重药理特征，为靶向替代性血管化的抗转移策略提供了候选分子与验证范式。

本研究为抗肿瘤转移药物研发提供了兼具生理相关性、动态可视化、多维量化能力的新型评价工具，将替代性血管化 —— 这一长期处于研究视野边缘的耐药机制 —— 纳入可控、可测、可筛的体外研究体系，为后续靶向肿瘤 - 血管交互的抗转移策略开发奠定了方法学基础。

原文链接：https://doi.org/10.1002/adfm.202526981

制版人：十一

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