抗体纯化回收率只有40%？先别换柱：检查一下你的IgG亚型

“明明都是IgG，为什么别人用Protein A纯化，回收率能做到90%以上，我的抗体却只有40%？”如果你做过抗体纯化，这种情况应该并不陌生。

回收率一低，通常都会先去查纯化条件柱子有没有问题、上样量是不是过高、缓冲液是否合适、洗脱条件是不是需要调整。

但如果这些条件基本正常，建议先别急着换柱。先看看你的抗体是什么IgG亚型。因为Protein A虽然是抗体纯化中非常经典的亲和配基，但它并不是对所有IgG都有同样的结合能力。

同样都是IgG，Protein A为什么会有不同的表现？

Protein A主要通过抗体的Fc区域与IgG结合。对于很多常见的Human IgG和Rabbit IgG，Protein A通常具有较好的结合表现，因此很多人在做抗体纯化时，会习惯性地认为：IgG → Protein A。

这个思路大多数时候没有问题，但不能简单地套用到所有抗体。不同物种、不同IgG亚型的Fc结构存在差异，这些差异会影响抗体与Protein A、Protein G等亲和配基的结合。

所以，当你发现纯化回收率明显偏低时，除了检查实验条件，也应该回头看看抗体本身。

尤其是一个很直观的判断方法，看看Flow-through里还有没有大量目标抗体。

如果上样之后，大量目标抗体没有被捕获，而是直接进入Flow-through，那么问题很可能发生在结合这一步。

这时候，与其先怀疑柱子，不如先问一句：这个抗体和Protein A真的匹配吗？

Mouse IgG1就是一个典型例子

如果你的目标抗体是Mouse IgG1，这个问题尤其值得注意。

在常见的亲和纯化体系中，Mouse IgG1与Protein A的结合相对较弱，而Protein G通常表现得更好。因此，用Protein A纯化Mouse IgG1时，有可能出现这样的情况：上样之后，Flow-through中仍然能检测到比较多的目标抗体，最终洗脱得到的抗体明显少于预期，回收率自然也就上不去。

如果这时候不断更换Protein A树脂，或者反复调整上样和洗脱条件，却始终没有明显改善，就值得重新考虑亲和配基本身。

对于Mouse IgG1，Protein G通常是更值得优先评估的选择。

当然，这并不是说Mouse IgG1绝对不能使用Protein A。实际结合效果还会受到配基来源、介质、缓冲体系、pH以及抗体本身等因素影响。

更准确地说：

Mouse IgG1通常不是Protein A的优势结合对象，而Protein G往往具有更好的结合表现。

所以，如果你看到的是“Mouse IgG1 + Protein A + 大量Flow-through + 低回收率”，那么与其一味优化纯化条件，不如先比较一下Protein A和Protein G的实际结合效果。

有时候，问题并不在后面的洗脱，而是在最开始的捕获阶段。

Protein G也不是Protein A的“升级版”

说到这里，很容易产生另一个误区，既然Protein G对Mouse IgG1更好，是不是以后做抗体纯化都应该直接用Protein G？

其实并不是，Protein A和Protein G并不存在简单的“谁更好”。不同抗体与两种配基的结合表现不同，最终还是要看目标抗体。例如，Rabbit IgG通常是Protein A非常经典的应用对象；Human IgG1、IgG2和IgG4也通常具有良好的Protein A结合表现。而对于Mouse IgG1，Protein G往往更值得优先考虑。

真正需要建立的习惯是不要看到IgG，就默认Protein A；先确认物种和亚型，再判断亲和配基。

如果不知道自己的抗体是什么亚型呢？

如果是自己表达或制备的抗体，通常应该能够从构建信息、表达体系或者抗体本身的设计中确认Isotype。

如果目前确实无法确定，也没必要一开始就投入大量样品去反复试错。可以先取少量样品，对Protein A和Protein G分别做一个小规模结合测试。重点不只是看最后洗脱出来多少，更要看Flow-through里还剩多少目标抗体。

如果Protein A组有明显的目标抗体流穿，而Protein G能够明显改善捕获，那么问题就比较清楚了：当前纯化条件下，Protein G可能更适合这个抗体。对于珍贵抗体来说，先做小规模验证，再决定后面的纯化方案，通常比直接放大实验更稳妥。

所以，回收率只有40%，先从哪里查？

如果下次再遇到类似问题，可以先回到最简单的判断：

第一，看Flow-through。

如果里面有大量目标抗体，优先考虑结合阶段的问题。

第二，看抗体。

确认物种和IgG亚型，不要只停留在“这是IgG”这一层。

第三，再看Protein A和Protein G是否匹配。

如果抗体本身与当前亲和配基的结合能力有限，那么继续调整其他条件，往往很难从根本上解决问题。

当然，如果Flow-through中目标抗体并不多，但最终回收率仍然很低，那么排查方向就应该转向洗脱、样品稳定性以及其他纯化条件。

换句话说“回收率低”只是结果，先找到抗体究竟损失在哪一步，才能知道真正的问题是什么。

别只看抗体靶点，Isotype也值得关注

这个问题其实也提醒了我们，选择抗体时不能只盯着Target，也可以顺手确认一下Host Species、Isotype、Clonality、Reactivity、Application，这些信息看起来只是产品参数，但在实际实验中，可能直接影响后续的实验设计。