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纳米孔平台 实现儿茶酚胺代谢全通路实时动态监测

儿茶酚胺，包括多巴胺、去甲肾上腺素和肾上腺素，是人体神经和内分泌系统中至关重要的调节分子，深刻影响着情绪、认知、心血管功能及应激反应。其代谢紊乱与帕金森病、抑郁症、注意力缺陷多动障碍等多种重大疾病密切相关。这些分子通过一条从必需氨基酸苯丙氨酸开始的复杂酶促反应通路合成。然而，直接、动态地监测这一代谢过程的酶促反应一直是科学界的难题。传统的检测方法，如质谱法、高效液相色谱法和酶联免疫吸附测定，往往缺乏实时、高灵敏度和低丰度检测的能力，难以满足在复杂生物环境中进行动态监测的需求。因此，开发一种能够实时、高灵敏地追踪整个代谢通路的新技术，对于深入理解其调控机制和疾病诊断具有重大意义。

针对上述挑战，中科院化学研究所吴海臣研究员与西华大学刘蕾副教授成功构建了一套整合了体外酶学重构与纳米孔单分子传感的创新平台。该研究在体外利用纯化的酶和辅因子，完整重建了从苯丙氨酸到肾上腺素的全部儿茶酚胺生物合成途径。通过在一个纳米孔内集成两种正交的分子识别模式，该平台实现了对通路中所有代谢中间产物和终产物的高特异性检测（图1a）。实时监测使得研究人员能够以单分子分辨率直接观察通路的动态进程和调控扰动。利用这一方法，他们揭示了6-甲基异硫氰酸酯破坏儿茶酚胺生物合成的机制，并为碘酪氨酸脱卤酶1缺乏症如何损害儿茶酚胺的产生提供了机理解释。相关论文以题为“Nanopore-enabled time-resolved monitoring of catecholamine-related phenylalanine metabolism”发表在最新一期《nature nanotechnology》上。

图 1 | 用于时间分辨监测儿茶酚胺相关苯丙氨酸代谢通路的纳米孔传感策略

单纳米孔内的双正交识别

研究的核心创新在于设计了一个功能化的耻垢分枝杆菌孔蛋白A（MspA）纳米孔。研究人员通过对MspA蛋白单体进行定点突变，引入半胱氨酸残基，并连接3-(马来酰亚胺)苯硼酸（MPBA），构建了MspA-PBA纳米孔。该修饰使得纳米孔能够通过可逆的硼酸酯键与儿茶酚胺类分子（如多巴胺、去甲肾上腺素等）特异性结合，从而产生特征性的电流信号。与此同时，团队设计了含有联吡啶基团的肽探针FG-Bpy-D₅。该探针在Cu²⁺介导下，能特异性识别苯丙氨酸和酪氨酸，并通过与葫芦[7]脲（CB[7]）的主客体相互作用，在纳米孔中产生另一类可区分的电流信号。这两种识别机制在同一纳米孔中协同工作，互不干扰，成功实现了对通路中全部六种关键代谢物（苯丙氨酸、酪氨酸、左旋多巴、多巴胺、去甲肾上腺素和肾上腺素）的同步区分与定量。

多组分同时检测与定量分析

在构建了两种正交识别体系后，研究人员系统验证了该平台对六种关键代谢物的识别特异性和定量能力。单独检测时，每种代谢物均能产生具有特征性电流阻断幅度和停留时间的信号事件，这些特征参数可用于分子身份的指认。进一步，将六种代谢物混合后检测，结果显示各代谢物的特征信号在散点图中能够清晰分离（图2a），充分证明了该平台优异的多元分辨能力。为了将信号频率与浓度相关联，研究人员建立了每种代谢物的校准曲线，结果表明在半对数坐标下，各代谢物的特征信号频率与其浓度呈现良好的线性关系（图2b），为后续定量分析提供了可靠依据。考虑到酶促反应体系中存在多种辅因子及其转化产物，研究人员还逐一检测了所有相关辅因子和副产物，以评估其是否产生干扰信号。结果显示，在六种通路代谢物与这些辅因子（如S-腺苷同型半胱氨酸、BH₄、二氢生物蝶呤和抗坏血酸）共存时，其特征信号在散点图中仍然保持良好分离，证实了该组合传感系统在实际酶反应体系中的选择性和可靠性。

图 2 | 示意图，展示儿茶酚胺生物合成途径中六种关键代谢物的检测

酶学反应验证与动力学参数测定

在实现代谢物精准检测的基础上，研究人员对通路中的五个关键酶——苯丙氨酸羟化酶（PAH）、酪氨酸羟化酶（TH）、芳香族L-氨基酸脱羧酶（AADC）、多巴胺β-羟化酶（DBH）和苯乙醇胺N-甲基转移酶（PNMT）——的活性及动力学进行了系统研究。通过监测各酶与其特异性底物的反应，他们获得了每种酶的米氏常数Km和最大反应速率Vmax。例如，PAH的Km=2.536±0.001 mM，Vmax=1.354±0.006 mM min-1（图3a）；TH的Km=7.702±0.005 mM，Vmax=0.219±0.003 mM min-1（图3b）；AADC的Km=14.242±0.010 mM，Vmax=1.156±0.002 mM min-1（图3c）；DBH的Km=3.600±0.006 mM，Vmax=0.315±0.002 mM min -1（图3d）；PNMT的Km=13.159±0.005 mM，Vmax=0.665±0.001 mM min-1（图3e）。这些数据不仅验证了纳米孔检测在酶学分析中的可靠性，也为后续研究完整代谢通路的动态变化奠定了基础。

图 3 | 对单个酶反应的研究

实时监控完整代谢网络

随后，研究人员将所有五种酶及其辅因子置于同一反应体系中，以苯丙氨酸为初始底物，启动完整的级联反应。通过在不同时间点取样并进行纳米孔分析，他们清晰地描绘了代谢网络的动态演变过程（图4a）。数据显示，在反应初始阶段（0-30分钟），底物苯丙氨酸的比例从100%迅速降至接近零，而酪氨酸在12分钟左右达到峰值（图4b-d）。随后，下游产物多巴胺、去甲肾上腺素和肾上腺素的浓度开始上升。值得注意的是，左旋多巴在整个反应过程中始终维持在极低水平，这表明酪氨酸羟化酶催化的羟化反应是整个级联反应的限速步骤，且酪氨酸羟化酶和芳香族L-氨基酸脱羧酶之间可能存在近乎完美的底物通道效应（图4d-e）。约50分钟后，整个酶促级联反应达到稳态，实现了对整个代谢轨迹的实时可视化。

图 4 | 纳米孔监测连续酶反应

解析DEHAL1缺乏症的影响

利用该平台的强大分析能力，研究人员进一步探究了碘酪氨酸脱卤酶1（DEHAL1）缺乏症导致儿茶酚胺产生受损的潜在机制。在甲状腺激素合成中，DEHAL1负责回收碘，其缺陷会导致单碘酪氨酸（MIT）和双碘酪氨酸积累并释放到血液中。通过在体外反应体系中加入MIT，研究人员模拟了该病症的代谢环境。结果显示，MIT的加入并未影响苯丙氨酸向酪氨酸的转化，但却显著抑制了下游的酶促反应，使得级联反应在20分钟后几乎停滞，最终仅检测到微量的儿茶酚胺（图5b-e）。该结果首次提供了直接证据，表明MIT通过抑制酪氨酸羟化酶活性来干扰酪氨酸代谢，从而损害儿茶酚胺的合成，为DEHAL1缺乏症相关的神经和发育异常提供了合理的分子解释。

图 5 | 甲状腺炎样疾病对儿茶酚胺代谢的影响

总结与展望

本研究通过将两种正交识别机制整合到单个MspA纳米孔平台，成功实现了对儿茶酚胺相关苯丙氨酸代谢通路的实时监测，并揭示了DEHAL1缺乏症抑制儿茶酚胺产生的可能机制。尽管该平台在体外展现了强大功能，但仍面临一些挑战，如生理浓度下灵敏度的提升、不同缓冲体系的兼容性问题，以及复杂生物基质中的抗干扰能力等。未来，通过结合微流控技术进行连续采样、优化纳米孔化学和孔道几何结构、以及发展更智能的自动化事件分类算法，有望进一步提高其分析性能和稳定性。这项研究不仅为神经递质代谢的动态研究提供了强大工具，更拓展了纳米孔传感从单一分析物检测到复杂生化通路动态解析的广阔前景。