Plant Cell | 复旦大学常芳团队花药单细胞图谱揭示生殖细胞与体细胞命运建立机制

近日，复旦大学生命科学学院常芳教授团队在The Plant Cell发表题为Cryptic Fate Priming and Lineage Stabilization during Arabidopsis Anther Development的研究论文。该研究利用高分辨率单细胞转录组技术，获得了66,864 个高质量单细胞转录组，系统重建了拟南芥花药从早期细胞命运建立到花粉成熟的连续发育过程。该研究解析了花药主要细胞类型，并发现了一个此前未被充分认识的早期 L2 层来源（Ar-d）过渡状态类群。围绕“共同来源的细胞何时开始走向不同命运”这一核心问题，研究提出了花药细胞命运建立的“隐性命运预启动（cryptic fate priming）-谱系稳定（lineage stabilization）”的新模型，并阐释了MADS转录因子SPL/NZZ参与建立早期 Ar-d 过渡程序，受体激酶EMS1则负责稳定绒毡层/体细胞发育轨迹并限制生殖命运过度扩张的功能和分子轨迹。该工作为经典花药形态学谱系模型补充了单细胞分子层面的新解释、鉴定了花药主要细胞类群的新的分子标签，并通过突变体解析了部分细胞类群特异性基因如LBDs的功能。

花药是植物产生雄性生殖细胞的场所，也是研究植物细胞命运决定的经典系统。与动物不同，植物雄性生殖细胞并不是在胚胎早期预先保留下来的，而是在花药这一体细胞器官中重新产生。

经典的形态学和遗传学研究建立的花药发育模型表明：在拟南芥花药早期，L2层来源细胞形成孢原细胞（archesporial cells, Ar），随后经过一系列有规律的分裂，产生初生造孢细胞（PSC）和初生周缘细（PPC）。其中，PSC进一步形成雄性生殖细胞，而PPC则继续产生次生周缘细胞（SPC），并最终形成绒毡层、中间层和药室内壁三层环绕生殖细胞的体细胞层。换句话说，领域内已经基于形态学和发育时间轨迹知道了这些细胞的空间位置和分裂方式，并推测了谱系来源模型。真正没有解决的问题是：当形态学上已经可以把PSC和PPC区分开时，它们在分子层面是不是也已经成为两种不同的细胞？如果答案是“是”，那么细胞命运可能伴随着一次较为迅速的转录程序切换；但如果答案是“不是”，那么形态学上的谱系分离与真正的分子命运建立之间，就可能存在一个此前没有被识别出来的过渡阶段。

传统组织水平的转录组将成千上万个不同细胞混合在一起，难以识别少量而短暂存在的中间状态；而经典遗传学往往能够告诉我们“某个基因缺失以后最终发生了什么”，却很难回答命运偏向究竟是在分化过程中的哪一步发生，以及发生时整个细胞处于什么转录状态。这正是研究团队希望通过单细胞技术回答的问题。

课题组通过优化单细胞分离和测序条件，共获得66,864个高质量单细胞转录组；在利用雌蕊样品作为器官参考、识别并去除潜在混杂细胞后，构建了包含45,959个高质量花药细胞的单细胞图谱，覆盖了从早期形态建成、细胞命运建立，到减数分裂、花粉成熟和花药后期发育的主要阶段（图1），从而使研究人员第一次能够在同一个连续的单细胞框架中追踪早期L2来源的体细胞，究竟如何一步一步转变为雄性生殖细胞，或者走向周围的体细胞命运。

Figure 1summarizes the construction of the Arabidopsis anther single-cell atlas.

细胞命运不是突然“分家”，而是在共同状态中逐步产生偏向

研究发现，经典形态学定义的花药早期Ar、PSC、PPC以及早期次生周缘细胞，这些细胞的命运并没有立即在转录组层面彼此分离。相反，它们整体上仍然保持高度相似，共同构成一个相对连续的过渡态类群。研究团队将这一早期L2来源过渡细胞群定义为Ar-d（archesporial-derived）过渡态细胞。这一结果表明，形态学上的谱系进程并不等同于细胞整体分子身份的同步切换。

那么，如果这些细胞整体上仍然如此相似，生殖细胞和体细胞命运究竟从什么时候开始分开？进一步结合拟时序分析及细胞间转录相似性分析，研究团队发现，即使位于早期发育分叉点两侧、未来将走向不同命运的细胞，在全局转录水平上仍然高度相似。真正最先发生变化的，并不是大规模的细胞类型特异基因同时开启，而是少量具有谱系偏向的转录程序率先出现（图2）。

研究共鉴定到7,910个沿发育轨迹动态变化的基因，并将其划分为41个共表达模块（图2）。其中，一些模块在不同谱系分叉附近呈现短暂而局部的增强。例如，M1在早期体细胞/绒毡层相关分支附近富集，并包含SPL/NZZ、ROXY2以及多个REM家族转录因子；M6在早期生殖谱系相关状态中增强；M3则与早期药室内壁相关方向的转录变化相关。

因此，花药细胞命运的建立并不像一个瞬间切换的“开关”。更准确地说，早期L2来源细胞首先维持一个共同的祖细胞样转录背景，在这个高度相似的状态中，少量具有方向性的转录程序开始出现偏向；随后，这些最初有限的差异才不断被放大，最终形成生殖细胞、绒毡层、中间层和药室内壁等稳定而彼此不同的分子身份。

Figure 2shows trajectory analysis of Ar-derived anther cells.

SPL/NZZ不是简单决定某一种命运，而是帮助细胞首先进入“可分化”状态

发现一个过渡态以后，一个更加关键的问题是：这个状态是真实存在的发育阶段，还是仅仅由计算分析推断出来的结果？为此，研究团队进一步将野生型图谱与花药早期发育关键调控因子SPL/NZZ的突变体进行单细胞比较。SPL/NZZ长期以来被认为是花药早期发育和孢子发生的重要调控因子。spl突变体无法正常形成生殖细胞，并表现出严重的花药发育缺陷。单细胞转录组分析显示，在spl-4中，正常的Ar-d过渡态细胞明显减少，其后续产生的生殖细胞、绒毡层和中间层等L2来源细胞也几乎消失。更重要的是，在残余的类Ar-d细胞中，野生型早期Ar-d及分支附近高度表达的Module 1显著降低（图3）。

因此，SPL/NZZ的作用并不能简单理解为“打开一个生殖细胞基因”。研究结果更支持这样一个模型：SPL/NZZ首先帮助早期L2来源细胞建立正常的Ar-d过渡程序，使这些细胞进入一种具备进一步产生不同L2来源命运能力的发育状态；在此基础上，生殖和体细胞谱系才得以继续展开。

Figure 3shows that SPL/NZZ is required for establishment of the Ar-d state.

EMS1的作用比传统认知的“决定绒毡层命运”更早，它负责把已经出现的体细胞倾向稳定下来

如果说SPL/NZZ负责让细胞进入正常的早期过渡状态，那么细胞已经出现命运偏向以后，又是谁帮助它真正“站稳队伍”？

研究团队进一步分析了经典花药细胞命运调控因子EMS1。EMS1编码受体激酶，是TPD1–EMS1–SERK信号通路的核心组成部分。传统遗传学研究已经发现，ems1突变体中绒毡层缺失，而造孢细胞数量增加，因此EMS1长期被认为是绒毡层命运建立的重要调控因子。但传统表型留下了一个难以回答的问题：EMS1究竟是在绒毡层已经产生以后负责维持其分化，还是在更早的时候就已经参与生殖与体细胞命运的分配？

为了回答这一问题，课题组获得了一个新的哥伦比亚野生型背景下的 EMS1 基因突变体 ems1-3，并验证了突变体表型与Ler 背景的 ems1-1突变体表型一致。单细胞分析表明，在野生型中，Ar-d细胞可以分别进入生殖细胞和体细胞/绒毡层相关轨迹；而在ems1-3中，Ar-d细胞向绒毡层方向的发展显著受阻，同时更多细胞表现出向生殖细胞相关状态偏移的趋势（图4）。

因此，EMS1的功能时间点可能比过去认为的更早。EMS1不是简单地在SPC 转变为绒毡层时发挥作用，而是在细胞刚刚出现绒毡层偏向时，就帮助稳定这一命运轨迹，并阻止细胞继续滑向生殖命运。这也使经典的 “绒毡层缺失、造孢细胞增多”的ems1表型获得了一种新的解释：失去EMS1后，并不仅仅是绒毡层发育失败，而是早期体细胞/绒毡层轨迹本身无法被稳定，导致部分Ar-d细胞进一步向生殖相关方向偏移。

Figure 4shows that EMS1 stabilizes the somatic/tapetal trajectory during early anther development.

EMS1还将体细胞命运建立与生殖细胞的表观遗传程序联系在一起

研究还发现，EMS1缺失带来的影响并不局限于绒毡层。在ems1-3的Ar-d和生殖细胞中，多种与染色质调控、DNA修饰和RNA介导DNA甲基化（RdDM）相关的基因发生改变。其中，CLSY3尤其值得关注。已有研究表明，CLSY3与绒毡层来源的小RNA形成及生殖细胞DNA甲基化重编程密切相关。在本研究中，CLSY3在正常Ar-d细胞中已经开始表达，并沿绒毡层方向维持；而在ems1-3中，其表达在早期Ar-d阶段就显著降低（图5）。同时，多个REM家族转录因子及RdDM相关基因也出现异常。

这提示，体细胞与生殖细胞之间的协同可能比过去想象得更早。过去，人们往往将绒毡层视为一种在形成以后为小孢子提供营养、脂质和花粉壁前体的“护理细胞”。而本研究提示，当绒毡层和生殖细胞的命运尚处在早期建立阶段时，两者之间相关的调控网络可能就已经开始协同搭建。当然，研究目前观察到的主要是转录层面的变化。EMS1如何进一步影响小RNA、DNA甲基化以及染色质状态，仍需要未来结合单细胞表观组、DNA甲基化和小RNA测序进一步解析。

从连续发育轨迹中寻找新的功能基因

除了回答早期细胞命运建立的问题，该研究的单细胞图谱还系统描绘了花药多个细胞谱系从产生到成熟的动态过程。沿着雄性生殖细胞轨迹，研究观察到从早期小孢子母细胞状态，到减数分裂、花粉发育和成熟的一系列连续转录程序；绒毡层则从早期命运建立逐渐进入代谢激活、花粉壁形成、脂质合成和运输以及后期功能成熟。对于过去分子研究相对较少的中间层和药室内壁，研究同样解析了其动态转录过程：中间层由早期代谢和环境响应状态逐渐走向退化相关状态；药室内壁则依次经历光合作用、细胞壁重塑、衰老和木质化等过程，与后期花药开裂功能相衔接（图5）。研究还鉴定了一系列新的细胞类型特异或富集表达基因，并通过RNA原位杂交和启动子荧光报告株验证其空间表达（图 6）。

进一步利用图谱筛选候选调控因子时，研究团队发现多个LBD转录因子呈现明显的谱系特异表达。其中LBD2和LBD20主要富集于绒毡层，而LBD28和LBD34主要富集于生殖细胞/小孢子谱系。CRISPR/Cas9构建的lbd2 lbd20和lbd28 lbd34双突变体均出现育性下降、花粉数量减少以及花粉活力和外壁形态异常（图7）。

以上结果也说明，单细胞图谱的价值不仅在于“描述有哪些细胞”，还能够依靠细胞类型和发育阶段信息直接指导新的可视化探针的建立和新功能基因发现。

Figure 5shows lineage-specific pseudotime trajectories of germline and tapetum development.

Figure 6validates marker genes for major anther cell types.

Figure 7identifies LBD transcription factors involved in pollen development.

过去数十年的细胞学观察和的遗传学研究，已经为花药发育建立了清晰的空间和谱系框架。本研究并不是要推翻这一经典模型。相反，它为经典模型补充了一个此前缺失的分子维度：形态上的分裂和谱系位置改变，并不意味着细胞整体分子身份已经同步完成分化。在早期花药中，具有共同L2来源的细胞可以在形态学上逐步进入不同位置，却仍然在较长一段时间内维持高度相似的全局转录状态。真正的细胞命运建立首先隐藏在少量调控模块的微弱偏向中。随着发育推进：共同的Ar-d祖细胞样状态，出现有限的谱系偏向，SPL/NZZ帮助建立正常的早期过渡程序，EMS1稳定体细胞/绒毡层方向并限制生殖命运扩张，大规模谱系特异转录程序逐渐建立，最终形成成熟的生殖与体细胞身份。

因此，细胞命运并不是一次瞬间完成的“开关”。它更像一个逐渐失去不确定性、不断放大早期微弱差异的连续过程。这一发现也暗示了一个更具有普遍意义的发育调控逻辑：在许多细胞分化体系中，未来命运可能早于成熟细胞类型特异表达程序而被“预置”。在细胞整体看起来仍然非常相似的时候，少量调控基因已经悄悄改变了未来发展的概率；随后，信号传导和转录调控网络再将这些初始偏向不断强化并稳定为最终命运。

复旦大学生命科学学院博士研究生王健正、周雪怡为论文共同第一作者，常芳教授为通讯作者，宾夕法尼亚州立大学马红教授、复旦大学博士研究生孙文慧、刘叶乔、李含霁、硕士研究生赵雨晗、谢欣怡、以及已毕业博士研究生张诗婷和雷镇泽参与了该研究。研究工作得到了科技部国家重点研发计划和国家自然科学基金的支持。

论文链接：

https://doi.org/10.1093/plcell/koag262