Nat Commun丨徐华强、吴灿荣、李勇团队以1.87 Å高分辨率结构揭示人源PLPP1的脂质界面组织与催化机制

细胞如何及时终止脂质信号，是维持组织稳态的重要问题。溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid,LPA）和鞘氨醇-1-磷酸（sphingosine-1-phosphate,S1P）等生物活性脂质广泛参与细胞迁移、发育、免疫和肿瘤进展。信号的强度与持续时间，既取决于这些分子的产生和受体识别，也受到局部分布及降解过程的影响。因此，理解脂质信号的生物学作用，需要同时关注其如何被激活，以及如何在适当的位置被关闭。

磷脂磷酸酶（phospholipid phosphatases,PLPPs）通过水解脂质的磷酸头基，参与终止相关信号。哺乳动物具有PLPP1、PLPP2和PLPP3三个密切相关的家族成员。它们共享保守的催化基序，在体外具有部分重叠的底物谱，却在体内表现出不同的生理作用。这提出了一个值得关注的问题：相似的催化体系，如何在不同的膜环境与空间组织中实现功能分化？

其中，PLPP1（又称LPP1）不仅参与脂质信号调控，也与免疫细胞的代谢状态相关。既往研究发现，PD-1信号可抑制肿瘤浸润CD8⁺ T细胞中PLPP1的表达，并与脂质过氧化和铁死亡增加相联系；恢复PLPP1表达则有助于保护T细胞并增强抗肿瘤免疫。这些发现凸显了PLPP1的生理意义，也使其如何识别脂质、完成催化及适应膜环境成为重要的分子问题。

近日，徐华强、吴灿荣、李勇团队合作完成的研究以 Lipid-organized tetramerization of PLPP1 defines the molecular basis of spatial lipid phosphate signaling 为题发表于Nature Communications。研究结合冷冻电镜、结构导向突变以及酶动力学，解析了全长人源PLPP1的1.87 Å apo结构和2.21 Å产物结合态结构，揭示了其C4对称四聚体构架、亚基界面的有序脂质位点，以及催化口袋中的精细相互作用。

优于2 Å的结构分辨率是本研究的突出亮点。高质量密度使代表性侧链构象、有序脂质及水分子能够被精细建模，将对PLPP1的认识从整体组装进一步推进到膜界面的局部化学环境，为解释脂质信号的终止过程提供了具体的结构依据。

1.87 Å结构让膜界面的分子细节清晰可见

对于嵌入膜中的酶，整体形状能够揭示其跨膜拓扑和组装方式，而催化与调控的解释还依赖更精细的信息：脂质头基如何被固定，脂肪链朝向何处，相邻侧链是否形成适宜的接触，以及水分子如何参与局部氢键网络。这些细节决定了结构观察能否转化为可检验的机制问题。

本研究的1.87 Å apo电镜重构清晰呈现了多类局部特征，包括芳香族及带电残基的侧链、N-连接糖基、膜内有序脂质样密度和水分子。尤其是在跨膜核心区域，高质量密度为分析蛋白质与脂质之间的接触提供了依据。这里的apo指未加入反应底物的状态，并不意味着蛋白周围没有结合脂质；相反，多个有序界面脂质位点正是该结构的重要发现。

研究团队通过颗粒分类与精修逐步提高重构质量。Apo样品在不施加对称性的C1重构中达到2.09 Å，在应用C4对称性后达到1.87 Å；产物结合态则分别达到2.45 Å和2.21 Å。不同重构共同支持四聚体构架，而高分辨率密度进一步为侧链、脂质及有序水分子的建模提供了条件。

四聚体构架将催化口袋定位于膜界面

结构显示，四个PLPP1亚基围绕中心轴排列，形成高度有序的同源四聚体。每个亚基包含六条跨膜螺旋（TM1–TM6），N端和C端均位于胞质侧，催化区域朝向细胞外侧。这一拓扑与其作为膜表面脂质磷酸酶的功能相一致，也界定了膜内脂质与催化中心之间的空间关系。

相邻亚基通过跨膜区的疏水接触，以及膜—水界面的氢键和盐桥相互连接。值得关注的是，亚基界面并非仅由蛋白质侧链构成：多个有序脂质样密度嵌入膜侧沟槽，并同时接触不同亚基。由此，研究得以在同一结构中分析蛋白质组装与局部脂质占位之间的联系（图1）。

1.87 Å分辨率的意义，因而体现在一系列可进一步验证的细节上。研究者可以从清晰的密度出发，选取脂质周围或亚基界面的关键残基，通过突变与酶活性分析检验其作用，将结构观察与功能证据相互联系。

图1｜1.87 Å高分辨率冷冻电镜结构揭示人源PLPP1的四聚体构架及精细分子细节。

a，PLPP1四聚体的电镜密度图，分别展示膜平面、细胞外侧和细胞内侧视角。四个亚基以不同颜色区分，界面处建模为PC（粉色）、PA（青色）和PIP₂（黄色）的脂质密度被突出显示。b，对应视角的四聚体结构，标示六条跨膜螺旋（TM1–TM6）和四条胞外螺旋（α1–α4）；结合脂质和N-连接糖基以棒状模型显示。c，单个亚基的电镜密度图及原子模型，按序列由N端至C端呈蓝至红渐变着色。d，亚基的跨膜拓扑，N端和C端均位于胞质侧。e，脂质、糖基、代表性氨基酸侧链及有序水分子的局部电镜密度，展示1.87 Å重构的精细结构信息。

三类界面脂质分布于不同膜深度

依据电镜密度的形状及局部化学环境，研究人员将三类亚基界面密度分别建模为磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酸（PA）和磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP₂）。这些位点具有不同的空间位置和化学环境，并与催化中心相分离，提示膜脂可能在底物之外参与PLPP1的局部结构组织。

PC位于膜中部至胞外侧边界附近的亚基间沟槽。其带有极性的磷酸胆碱头基由周围残基定位，脂肪链则伸入疏水口袋，与相邻亚基的侧链形成接触。高分辨率密度还揭示，头基附近存在有序水分子参与的氢键网络，使脂质与蛋白质之间的联系能够从直接接触延伸到水介导的相互作用。

PA对应的密度位于胞质侧膜叶，在相邻亚基的跨膜螺旋之间形成另一处结合位点。其较小的磷酸头基与周围极性及带正电残基相互作用，脂肪链由局部疏水环境容纳。PIP₂则位于四聚体胞质侧边缘，其带多个负电荷的头基朝向富含碱性残基的界面口袋。不同脂质位点共同展示了PLPP1表面如何适配脂质头基及脂肪链的化学特征。

这些观察使膜脂在四聚体中的位置具有了明确的结构描述：它们占据离散的界面沟槽，在不同膜深度接触邻近亚基，可能参与局部组织或稳定。对于膜内代谢酶而言，这提供了一种理解脂质环境的方式——膜脂的分布与结合位置，可以成为酶结构的一部分。

界面残基影响活性但作用不限于四聚体解离

为检验这些位点的功能相关性，研究团队对界面脂质周围的残基进行了定点突变。F167A、H224A、W225A和K100A等突变显著降低了磷酸释放实验中的活性信号，表明远离催化中心的界面区域同样可能影响PLPP1功能。

寡聚状态分析进一步显示，活性下降与四聚体减少并非简单对应。Y47A和R125A的表观四聚体比例降低，但仍保留较明显的酶活性；部分活性显著受损的突变体则仍保留较多高阶寡聚体。这提示界面区域对功能的影响，可能涉及局部构象或相互作用网络的改变，不能完全归因于组装解离。

因此，结构与功能结果共同支持界面区域的重要性，同时为后续实验划定了具体问题：不同脂质是否具有可区分的作用，脂质占位如何影响局部构象，以及这些变化如何与催化功能相联系。现有结果尚不能证明某一种脂质是四聚体形成的必要条件，也未确定各类脂质之间存在功能层级（图2）。

图2｜PLPP1的界面脂质结合位点及水介导的相互作用。

a、b，两个视角下的亚基界面PC结合位点，蓝色网格为电镜密度；中间展示相邻两个亚基及PC、PA和PIP₂的位置。c，PC头基及其通过有序水分子与相邻亚基形成的相互作用。d，野生型和界面位点突变体的相对磷酸酶活性，通过无机磷酸释放实验测定并以野生型归一化。数据为3次独立生化实验的均值±标准误；采用单因素方差分析及Dunnett多重比较检验，ns表示差异不显著，*P < 0.05，**P < 0.01，****P < 0.0001，均与野生型比较。e、f，胞质侧膜叶的PA结合位点、电镜密度及周围残基。g、h，胞质侧膜叶的PIP₂结合位点、电镜密度及参与协调的残基。

2.21 Å产物结合态揭示磷酸头基的识别方式

在获得apo结构的基础上，研究团队将PLPP1与LPA孵育，解析了2.21 Å分辨率的水解后产物结合态结构。催化口袋内出现被指认为无机磷酸（Pi）和单酰甘油（MAG）的密度，为理解反应产物如何被容纳和定位提供了直接结构依据。

这一结构将脂质水解后的两个部分同时置于可分析的空间环境中：Pi位于由保守极性残基构成的催化中心，MAG的脂肪链则伸入与膜相连的疏水区域。蛋白质因此能够在同一口袋附近适配磷酸基团的亲水性与脂肪链的疏水性，揭示了膜—水界面催化所需的局部结构安排。

在催化中心，K120、R127、E162、R217和H223等残基参与构成围绕Pi的静电及氢键网络。有序水分子进一步将Pi与E162和S169联系起来，组织局部溶剂环境。高分辨率结构使这些水分子的位置及其与周围基团的关系可以被具体描述，为理解磷酸头基的稳定与定位提供了更精细的依据。

结构与酶学共同支持组氨酸介导的催化机制

催化组氨酸H171位于适合参与亲核进攻的位置，与组氨酸介导的磷酸基团转移机制相一致。结合保守催化位点及Pi的协调方式，这些结果支持涉及磷酸组氨酸中间体的反应机制。需要区分的是，当前直接解析的是水解后的产物结合态，反应中间体及完整催化过程仍需其他证据进一步刻画。

酶动力学分析显示，纯化PLPP1能够水解LPA，表观Km为147.9 ± 15.8 μM，表观kcat为54.0 ± 3.9 s⁻¹。这些参数描述了相应实验条件下的底物浓度依赖性与催化周转，为结构导向的功能分析提供了参照。

突变实验进一步显示，H171A以及K120A、R127A、S169A、R217A和H223A等突变，使活性信号降至接近实验对照的水平；E162A也显著降低活性。这些结果将结构中观察到的磷酸协调及局部水网络，与可测量的酶功能联系起来。Apo与产物结合态之间没有明显的整体或局部构象差异，也表明目前捕捉到的两个状态保持了相近的总体构架（图3）。

在C4对称重构中，四个口袋均可见产物相关密度；未施加对称性的C1重构也在相应位置显示相关密度，但局部强度有所不同。因此，结构支持产物结合位点的存在，而各亚基在动力学上是否等效或彼此独立，仍需专门实验检验。

膜侧通道提示脂质底物接近催化中心的路径

LPA具有疏水脂肪链，如何从膜环境接近催化中心，是理解PLPP1工作方式的关键。产物结合态结构中，MAG的脂肪链伸入朝向膜的疏水通道，与F24、T28、Y56、I64、I68和L106等残基形成接触。该通道与催化口袋相连，提示LPA可能通过膜侧向路径进入，并将磷酸头基定位于催化中心。

通道的几何形状与单酰链脂质相容，也可能参与对不同底物的选择。由于当前结构展示的是水解后的状态，这一路径仍属于结构支持的工作模型。底物如何进入、产物如何释放，以及这些步骤是否伴随短暂的局部构象变化，将是进一步理解催化循环的重要问题。

研究还对四聚体中央的跨膜腔体进行了分析。其膜内中部以疏水环境为主，并有脂质样分子的脂肪链占据部分空间。全细胞膜片钳实验在所测试条件下未检测到PLPP1特异性离子电导，与该腔体的结构特征相一致，支持PLPP1作为膜内脂质磷酸酶的功能解释。

以分子细节连接膜脂环境与信号终止

这项研究将PLPP1的四聚体构架、界面脂质、局部水网络与产物识别纳入同一结构框架。其中，1.87 Å重构提供了精细观察蛋白质—脂质界面的条件，2.21 Å产物结合态则将这些观察进一步延伸至催化中心。结合酶学与突变结果，研究为解释PLPP1如何在膜界面完成脂质去磷酸化提供了分子依据。

这些成果为进一步比较PLPP家族成员的功能差异，以及探索膜脂组成、寡聚状态与酶活性之间的关系奠定了基础。结合PLPP1在免疫细胞脂质代谢与铁死亡中的已有发现，未来可进一步研究这些结构特征如何影响细胞内的脂质应激与信号稳态，并为相关调节策略的探索提供依据。

李云海与袁青宁为论文共同第一作者。袁青宁负责本研究的高分辨率冷冻电镜结构解析。徐华强、吴灿荣和李勇为论文共同通讯作者。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-026-78196-3

制版人： 十一

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