让衰老大脑长出更多新神经元，这篇 Nature 怎么做到的

随着年龄增长，神经干细胞（NSCs）越来越难从静息状态重新「醒来」，新生神经元也随之减少。Nature 发现有意思的现象，衰老 NSCs 越「吃糖」，反而越难被唤醒；限制其葡萄糖摄取，更容易被激活[1]。

一个衰老问题，如何一步步做到葡萄糖代谢

当然不是先盯着代谢做机制，而是提了一个更直接的问题：敲除哪些基因，能让老年 NSCs 重新进入激活状态？答案要从年轻与老年 NSCs 的平行全基因组 CRISPR 筛选开始。

整体思路：老年 NSCs 激活障碍（功能表型）→ 年轻/老年平行全基因组筛选 → 筛出衰老特异性调控基因 → 老年小鼠脑内二次筛选 → 锁定葡萄糖转运蛋白 4 → 解析葡萄糖摄取与细胞激活的关系。

创新设计：本研究首次建立系统性、可拓展性平行全基因组筛选和体内遗传筛选平台。以功能表型恢复为指标，而不是简单寻找差异或变化最大的分子。

研究启发：从常见问题出发，把宽泛的 NSCs 衰老具体化为静息细胞能否重新激活这一可实验验证的功能表型。体外和体内筛选联用，避免直接从大量差异基因中直接挑机制。从发现基因到锚定关键基因，再到机制解析，形成层层推进的闭环。

实验设计思路

1. 从衰老表型出发，哪些基因限制 NSCs 激活？

作者首先从年轻和老年小鼠脑室下区分离原代 NSCs，建立静息—激活培养体系，分别进行全基因组 CRISPR–Cas9 敲除筛选。

筛选设置两个分析时间点，第 4 天通过 Ki67 染色和流式分选评估细胞能否成功从静息状态重新激活；第 14 天则利用长期细胞培养的自然富集，筛查能够维持持续自我更新和增殖能力的基因敲除。

关键点在于，研究直接比较年轻和老年两套筛选结果，从而将普遍影响 NSCs 激活的基因与在衰老状态下限制细胞激活的基因区分开来。筛选发现葡萄糖摄取、初级纤毛等相关基因在老年细胞中特别突出，为后续体内筛选提供了明确方向。

2. 体外筛出的候选，在老年大脑里真的有效吗？

体外筛选通量高，但无法完全模拟老年脑内生理状态。因此在老年 Cas9 小鼠中建立体内筛选体系，通过脑立体定位注射，将携带候选基因向导 RNA 的慢病毒注入侧脑室附近的神经干细胞区域。

筛选设计很巧妙，侧脑室下区 NSCs 被激活后，会产生神经祖细胞和神经母细胞，并沿迁移通路进入嗅球。因此直接利用这一生理过程，侧脑室下区感染 → 基因敲除 → NSCs 激活及产生后代 → 向嗅球迁移 → 5 周后检测嗅球中富集的 RNA，以富集程度作为体内功能筛选指标。

最终发现 24 个基因敲除在至少一次体内筛选中显著富集，其中 7 个在 3 次筛选中至少重复命中 2 次。葡萄糖摄取/人类疾病这一组表现最强，10 个候选中有 9 个至少在一次体内筛选中达到显著富集。

3. 在筛选的候选中，为什么选择葡萄糖转运蛋白 4（GLUT4）？

经过体外和体内两次筛选后，研究并没有简单选择排名第一的基因，而是结合筛选稳定性、通路聚集性和生物学可解释性。

对编码 GLUT4 蛋白的基因 Slc2a4 进行单独验证：

• 通过脑立体定位注射，将针对 Slc2a4 的向导 RNA 导入老年小鼠侧脑室下区；

• 采用 GLUT4 免疫荧光验证体内敲除效率；

• 结合 EdU 示踪和 NeuN 等神经元标志物染色，追踪新生细胞及其神经元分化；

• 检测侧脑室下区静息 NSCs、激活 NSCs 和神经母细胞的数量变化。

结果显示，敲除 Slc2a4 后，老年小鼠神经发生增强，短期内并未出现明显的 NSCs 耗竭。老年侧脑室下区 NSCs 中的 GLUT4 表达也高于年轻小鼠。

4.葡萄糖摄取真的参与了 NSCs 衰老吗？（研究闭环）

为了验证真正起作用的是不是葡萄糖摄取，研究没有停留在 GLUT4 基因本身，而是从表达、代谢表型和功能干预三个层面验证：

（1）通过单细胞转录组分析和免疫荧光检测，结果显示 Slc2a4/GLUT4 在老年静息 NSCs 中明显升高。葡萄糖摄取实验也说明老年 NSCs 的葡萄糖摄取高于年轻细胞。

（2）利用细胞外酸化率（ECAR）和氧消耗率（OCR）评估细胞能量代谢水平，结果显示老年静息 NSCs 具有出糖酵解增强、线粒体呼吸降低的代谢特征。敲除 Slc2a4 后，葡萄糖摄取及糖酵解水平下降，提示 GLUT4 可能通过调节葡萄糖摄取参与老年 NSCs 的代谢重塑。

（3）最后做功能干预，验证葡萄糖利用是否真正影响细胞激活。

• 基因手段干预：敲除 Slc2a4，降低葡萄糖摄取，促进老年 NSCs 重新激活。

• 葡萄饥饿：短暂去除葡萄糖，可选择性促进老年 NSCs 的激活能力

• 糖酵解干预：使用 2-脱氧葡萄糖抑制糖酵解，也能促进老年 NSCs 激活。

由此研究进一步证明，老年静息 NSCs 处于葡萄糖摄取升高的状态，而通过遗传或营养方式限制葡萄糖摄取或利用，可增强其重新激活的能力。

主要结果

1、全基因组筛选发现老年 NSCs 特异性调控因素

年轻与老年神经元干细胞全基因组筛选结果存在明显差异，说明调控 NSCs 静息—激活转换的因素会随年龄发生改变。进一步功能富集发现，老年细胞特异性候选基因主要涉及初级纤毛、胞质核糖核蛋白结构以及葡萄糖转运等过程。

2、建立老年小鼠体内 CRISPR 筛选平台，对体外候选基因进一步「复筛」

为了判断培养皿中筛出的候选在真实老年脑环境中是否仍然有效，研究进一步建立了体内 CRISPR 筛选平台。体内筛选显示只有部分体外候选能够在老年小鼠脑内稳定富集，其中与初级纤毛、葡萄糖摄取和胞质核糖核蛋白结构相关的候选再次出现，尤其葡萄糖摄取相关基因整体表现突出，这也将研究方向指向葡萄糖代谢。

3、锚定关键因子 GLUT4，调控老年小鼠脑内神经发生

在体内外筛选中，编码葡萄糖转运蛋白 4 的 Slc2a4 均稳定富集。通过单基因敲除进一步验证 Slc2a4 功能，EdU 示踪、NeuN 等神经元标志物染色发现，Slc2a4 敲除可增加老年小鼠嗅球中新生神经元的产生。静息 NSCs、激活 NSCs 及神经母细胞数量均增加。此外，老年 NSCs 中的 GLUT4 水平高于年轻细胞。这些结果提示，降低 GLUT4 不仅能促进老年 NSCs 激活，还能够进一步增强脑内神经发生。

4、老年 NSCs 葡萄糖摄取升高，限制葡萄糖利用可恢复细胞激活

既然 GLUT4 是葡萄糖转运蛋白，研究进一步检测其代谢变化。通过葡萄糖摄取实验、细胞外酸化率和氧消耗率检测发现，老年静息 NSCs 的葡萄糖摄取增加、糖酵解增强，以及线粒体呼吸降低。但敲除 Slc2a4 后，葡萄糖摄取和糖酵解均下降。

至此，研究从遗传筛选进一步到代谢分析，建立了 GLUT4 升高、葡萄糖摄取增强与老年 NSCs 激活受限之间的功能联系，实验结果证明限制葡萄糖利用可以改善衰老表型。

小编点评

这篇文章真正值得借鉴的，不只是做了全基因组筛选，而是如何通过对照设计、体内复筛和多层机制验证，把一个大规模筛选逐步形成可以解释的机制闭环。

1.做正确且高效的全基因组筛选

体外与体内筛选平台的建立是本研究的最大亮点，也是找到关键靶点的基础。本研究这两点很有价值，一是将年轻和老年细胞放在同一套筛选体系中平行筛选。二是全基因组筛选在体外完成，再缩小候选范围进行体内二次筛选。对于难以直接开展大规模动物筛选的研究，这种二次筛选可以考虑。

2、选候选基因不要只看排名，更要结合多条证据

研究最终聚焦 GLUT4，并不是单纯因为某一次筛选排名靠前，而是因为体外筛选、体内筛选、同类葡萄糖转运基因以及年龄相关表达变化都不断指向葡萄糖摄取这方面。这对筛选型课题很重要。拿到几十甚至上百个候选后要综合考虑多次筛选是否重复命中、是否富集、体内外结果是否一致，以及是否能够验证。

3、从基因有效到具体机制，需要不同干预方式得到同样结果

如果一个候选基因指向某条代谢或信号通路，可以进一步使用遗传干预/药理干预/培养条件改变进行交叉验证。不同手段得到一致表型，比单纯增加更多基因或蛋白检测，更能说明真正起作用的是哪一个通路。

4、同一个筛选体系，可以设置不同时间点回答不同问题

本研究并不是只在一个时间点读结果，而是分别观察早期重新激活和长期扩增/自我更新。前者用 Ki67 和流式分选，后者则让具有持续增殖优势的细胞自然富集。

我们自己做筛选时，不一定只能设置一个检测终点。对于激活/增殖/分化/存活等类似的连续过程，可以通过不同时间点拆开判断候选基因到底在哪个阶段起作用，避免把不同生物学过程混在一起。

参考文献：

1. Ruetz TJ, Pogson AN, Kashiwagi CM, et al.CRISPR-Cas9screensreveal regulators of ageing in neural stem cells. Nature. 2024 Oct;634(8036):1150-1159. doi: 10.1038/s41586-024-07972-2

编辑：小 z

题图：图虫