Nature | 引导组装（Prime assembly）实现大片段DNA定点整合与基因组重排

撰文|木兰之枻

大片段DNA定点整合与基因组重排对疾病治疗有非常重要的意义：众多遗传病可由同一基因中的不同致病突变引起，如果能够整体替换突变热点区域，或在内源位点精准插入功能性基因，就有望用一套治疗方案覆盖多种突变。然而，传统同源定向修复（homology-directed repair，HDR）主要发生于细胞周期的S/G2期，难以用于非分裂细胞；此外，核酸酶造成的DNA双链断裂还可能伴随插入缺失及复杂重排，极大限制了其临床应用前景。2019年，David Liu实验室开发的引导编辑（prime editing，PE）实现了不依赖双链断裂的DNA精准编辑，解决了小片段DNA定向删减的难题【1】（详见BioArt报道：）。常规PE主要适用于短片段DNA的编辑，虽然将PE与整合酶结合可实现大片段DNA定点插入，但需要额外的蛋白组分和重组步骤方能实现【2】，此外，双链DNA供体本身也可能引发细胞毒性，限制了该策略的广泛应用。分子克隆领域常用的Gibson组装技术可利用不同DNA片段单链末端的互补实现多片段DNA的高效体外组装【3】，而PE编辑可在基因组特定位点产生可编程的单链DNA末端，这提示研究者或可借鉴Gibson组装原理，在细胞乃至动物水平实现多个DNA片段的原位组装和定向整合，这为突破大片段DNA定点整合及复杂基因组重排技术瓶颈提供了新的思路。

近日，美国波士顿儿童医院、哈佛医学院的Daniel E. Bauer与加拿大拉瓦尔大学的Sébastien Levesque等研究者在Nature在线发表了题为Targeted genomic integration and rearrangement using prime assembly 的研究论文。文章开发了新的引导组装（prime assembly，PA）策略，通过引导编辑PE定向合成的双侧3′单链flap与外源DNA供体配对，可在人体细胞中实现多片段DNA组装和定点整合，并可进一步拓展至兆碱基级基因组重排。此外，PA介导的DNA组装与整合不依赖细胞分裂，为在非分裂或低增殖细胞中开展大片段DNA定点整合及复杂基因组重构奠定了基础。

引导组装PA的设计思路如下：由成对的pegRNA介导PE在基因组目标区域两侧合成3′单链flaps，使其分别与单链DNA供体或带3′突出端的双链DNA供体互补配对，最后借助细胞内源修复实现大片段DNA定点整合替换。研究者首先以先天性角化不良相关基因TINF2为靶点，对其第6号外显子中106 bp长度的突变热点区域进行同义替换。利用合成的单链DNA供体，研究者可在K562细胞中实现效率为30%的DNA替换，并可通过对供体DNA末端以硫代磷酸酯键进行保护后将效率提高至33.1%。后续实验发现，PA也会在靶位点产生单链flap整合、小片段DNA缺失或插入等非精准编辑事件，这可通过联合抑制NHEJ（DNA-PK抑制剂AZD7648）和MMEJ（DNA聚合酶θ抑制剂PolQi1）所介导的末端连接进一步降低非特异性编辑，最终提高精准编辑效率。

随后，研究者将PA拓展应用于大片段转基因的定点整合，并使用可直接与目标单链flap配对的3’-odsDNA（带3′突出端的双链DNA）作为供体开展研究。结果显示，在K562细胞的IL2RG位点，通过优化sgRNA骨架并联合使用NHEJ/MMEJ抑制剂或53BP1抑制剂，PA介导的大片段DNA定向整合效率可达15.3%-21.2%。研究者进一步证实，普通线性双链供体（dsDNA，无3’突出端）可替代3’-odsDNA用于PA介导的大片段DNA定点整合，且在NHEJ抑制剂的条件下定向整合效率可达25.9%。研究还发现，随着成对pegRNA介导的单链切口间距增大，PA的编辑效率有所下降；但总体而言，PA仍可实现千碱基尺度的DNA序列有效替换。此外，PA介导的整合效率随供体模板长度增加而降低：在K562细胞的AAVS1位点，9.1 kb和12.1 kb供体模板的定向整合效率分别为28.1%和7.4%。

多片段同步组装是Gibson组装为代表的分子克隆的一大优势。为评估PA是否具备类似能力，研究者将3.2 kb的供体DNA拆分为多个片段，结果显示在四片段时的定向整合效率仍可达18.2%（完整供体为57.7%）；经嘌呤霉素筛选后，阳性细胞比例可达96.0%。这表明PA能够在细胞内实现多个供体DNA片段的组装，并将其有效整合至基因组靶位点。

之后研究者将PA与HDR、非同源依赖的靶向整合（HITI）、微同源介导的靶向整合（MMTI）以及PE辅助整合酶系统PASSIGE进行比较分析。结果显示，在AAVS1位点PA的定向整合效率优于其他系统；但在IL2RG位点，PASSIGE的整合效率略高，说明平台优势具有位点依赖性。研究还发现，在Jurkat细胞的TRAC位点，PA系统与NHEJ和MMEJ抑制剂联用后的定向整合效率可显著提升至17.4%，达到PASSIGE系统的10.2倍。随后，研究者通过Drop-off实验评估了各系统对野生型等位基因的影响，发现包括PA在内的各定点整合系统均可造成较高比例的等位基因破坏，提示仍需进一步改进以减少非精准编辑事件。Donor-seq分析则显示，与HITI和MMTI等核酸酶依赖型策略相比，PA在AAVS1和IL2RG位点的精准整合比例更高，且pegRNA/gRNA依赖的脱靶整合频率更低，表明其在整合的精准度和特异性方面具有优势。

鉴于原代造血干细胞对双链DNA的敏感性，研究者进一步探索了以单链DNA（ssDNA）为供体的PA定点整合策略。通过设计由一条长单链DNA供体与一条短单链DNA供体配合的非对称组装方案，研究者在CD34⁺造血干/祖细胞中实现了效率为1.3%–1.5%的大片段DNA定点整合，且细胞存活率可达60.8%–82.9%。这些结果证实了PA结合ssDNA供体在治疗性原代细胞中实现DNA定点整合的可行性，但其整合效率仍明显低于常规细胞系，尚需进一步优化。

在大尺度基因组重排方面，研究者将PA介导的大片段删除与嘌呤霉素抗性标记整合相结合，在K562细胞7号染色体上实现了约1 Mb片段的精准删除，且采用单链DNA供体时，经嘌呤霉素筛选获得的48个单细胞来源克隆均携带预期缺失。之后研究者进一步以核酸酶型PE替代切口酶型PE，构建了核酸酶型PA（nuclease PA），并实现了兆碱基级倒位、染色体臂缺失及易位，将PA体系的应用拓展至更复杂的染色体重排。最后，研究者在原代非分裂细胞中进一步验证了PA系统介导大片段DNA定点整合的能力，提示其具有更广泛的应用潜力。

综上所述，本研究将PE介导的可编程单链flap生成与细胞内DNA组装相结合，建立了兼容单链和双链DNA供体的引导组装（PA）平台。该平台支持外显子重编码、大片段定点整合及基于多片段拼接的定点整合，并可结合筛选实现兆碱基级删除及染色体重排。PA在非分裂细胞中的编辑活性进一步拓展了其适用范围，为功能基因组学研究及基因与细胞治疗提供了新的工具。

https://doi.org/10.1038/s41586-026-11024-2

制版人： 十一

参考文献

1. Anzalone, A. V. et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA.Nature576, 149-157 (2019).

2. Yarnall, M. T. N. et al. Drag-and-drop genome insertion of large sequences without double-strand DNA cleavage using CRISPR-directed integrases.Nat. Biotechnol.41, 500-512 (2023).

3. Gibson, D. G. et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.Nat. Methods6, 343-345 (2009).

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